鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与序列测定

第２６卷第１期　２００８年２月　石河子大学学报（自然科学版）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　Ｖｏ１．２６　Ｎｏ．１　Ｆｅｂ．２００８　文章编号：１００７—７３８３（２００８　Ｊ０１—０ｏ６４一ｏ４　鸭瘟病毒强、弱毒株ＴＫ基因的克隆与序列测定　谢秀兰　，杨发龙　，李阳友　，岳华　（１西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都６１００４１；２川北医学院微生物与免疫学教研室，四川南充６３７０００；　３　ＪｌＩ￣ＩＬＮ学院实验动物中心，ｌ￣ｌＪｌｌ南充６３７０００）　摘要：根据ＧｅｎＢａｎｋ上已发表的鸭瘟病毒　基因核苷酸序列，设计并合成了１对引物，分别扩增鸭瘟病毒标准强　毒株（ＤＰＶ＿Ｆ３４）和鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株（Ｃ－ＫＣＥ）的　ｒＫ基因，将它们分别克隆人ｐＢＳ－Ｔ载体，转化ＴＯＰ１０大肠杆　菌，对阳性的重组质粒进行序列测定。结果表明：ＤＰＶ—Ｆ３４与ＤＰＶ　Ｃ－ＫＣＥ的　基因长度均为１０７７ｂｐ，编码３５８个氨　基酸，二者的核苷酸与氨基酸组成具有很高的同源性，分别为９９．４％和９８．９％。　关键词：鸭瘟病毒；ＤＰＶ—Ｆ３４；Ｃ—ＫＣＥ；ＴＫ基因；克隆；序列测定　中图分类号：￥８５８．３２　文献标识码：Ａ　鸭瘟（Ｄｕｃｋ　ｐｌａｇｕｅ）是由鸭瘟病毒（Ｄｕｃｋ　ｐｌａｇｕｅ　ｖｉｒｕｓ，ＤＰＶ）引起的鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种　急性、热性、败血性传染病…１。鸭瘟病毒又称为鸭肠　炎病毒（Ｄｕｃｋ　ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｖｉｅｓ，ＤＥＶ），在分类上属于疱　ｒ疹病毒科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ），ｄ一疱疹病毒亚科（Ａｌｐｈａ　ｈｅｒ－　ｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ），具体属的定位还不清楚。目前对鸭瘟病　毒基因结构及功能的研究还比较滞后，仅有部分毒　株的ＵＬ６，ＵＬ７基因、聚合酶基因、ＴＫ基因、ＧＨ基因　的克隆和测序见报导ｌ２，３ｊ。胸苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉ—　Ｂａｓｅ，ＴＫ）基因是疱疹病毒的主要毒力基因和病毒增　殖的非必需基因＿４ｊ，其编码产物胸苷激酶是嘧啶生　物合成补救途径中所必需的酶。它可使胸腺嘧啶磷　１材料与方法　１。１　材料　１．１．１　病毒　鸭瘟标准强毒株（ＤＰＶ—Ｆ３４）：购自中国兽药监　察所；鸭瘟弱毒株：为鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗株（Ｃ—　ＫＣＥ），购自中牧实业股份有限公司成都药械厂。　１．１．２酶及试剂　Ｔ４　ＤＮＡ连接酶、ｐＢＳ—Ｔ载体及ＴＯＰ１０感受态细　胞均购自北京天为时代；Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶为ＴａＫａＲａ　公司产品；　３ｓ柱离心式琼脂糖ＤＮＡ小量快速纯化试剂盒　购自上海申能博彩生物科技公司；１３常型质粒ＤＮＡ　小量快速提取试剂盒购自Ｖ—ＧＥＮＥ公司；蛋白酶Ｋ　为ＭＥＲＣＫ产品；其它试剂均为国产分析纯。　酸化为ｄＴＭＰ，然后继续磷酸化成为ｄＴｒＰ，参于病毒　ＤＮＡ的合成，在神经组织感染及潜伏性感染中具有　重要作用　＇６ｊ。　利用基因敲除技术，去除病毒ＴＫ基因，可使病　毒毒力下降，但不改变其免疫原性＿７ｊ，利用该原理国　内外已研制出了缺失ＴＫ基因的伪狂犬病及牛传染　性鼻气管炎等的基因缺失苗［　。为可能研制鸭　瘟病毒ＴＫ基因缺失苗提供清楚的分子生物学背　景，也为积累鸭瘟病毒的基因资料，本研究同时克隆　了鸭瘟病毒标准强毒株（ＤＰＶ—Ｆ３４）及鸭瘟鸡胚化弱　１．２方法　１＿２．１病毒ＤＮＡ的提取　ＤＰＶ—Ｆ３４以５００ＥＬＤ５０接种鸭胚成纤维细胞，待　７０％～８０％的细胞出现典型的细胞病变时，４０００ｒ／　ｍｉｎ离心２０ｒａｉｎ，沉淀用无钙镁ＰＢＳ重悬，４０００ｒ／ｍｉｎ　离心２０ｍｉｎ，将沉淀物转移至ｌｍＬ的离心管，加入１／　１０体积的１０％ＳＤＳ和终浓度为ｌＯＯｔ￣ｇ／Ｌ的蛋白酶　Ｋ，轻柔混匀后，５６ｑＣ温育１ｈ裂解病毒。　以等体积的酚一氯仿一异戊醇（２５：２４：１）抽提病毒　毒疫苗株（Ｃ—ＫＣＥ）的　基因，并进行了序列测定和　初步比较。　收稿日期：２００７—１２．０８　作者简介：谢秀兰（１９８０－），女，助教，硕士，从事禽病病原的分子生物学研究；ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｕｌａｎｘｉｅ＠ｙａｈｏｏ．ｅｎ。　通讯作者：岳华，女，教授，博士，从事预防兽医学和分子生物学研究。　维普资讯 http://www.cqvip.com

第１期　谢秀兰，等：鸭瘟病毒强、弱毒株　基因的克隆与序列测定　６５　ＤＮＡ　２次，再以等体积的氯仿一异戊醇（２４　１）抽提１　次，小心吸取上清层后，在上清中加入１／１０体积的　ＮａＡｃ（ｐＨ　７．０）和２倍体积的无水冰乙醇沉淀ＤＮＡ，　１００００×ｇ离心２０ｍｉｎ，以７５％的乙醇洗涤沉淀，静置　１０ｍｉｎ后１００００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清液后将管　子倒扣在吸水纸上自然风干，沉淀即为病毒基因组　ＤＮＡ，以ＴＥ溶解后一２０￣Ｃ冰箱保存。　在提取疫苗毒株Ｃ—ＫＣＥ　ＤＮＡ时，先在疫苗瓶中　加入２ｍＬ灭菌水，６５℃温浴５ｒａｉｎ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心　５ｒａｉｎ取上清，其余操作均与ＤＰＶ—Ｆ３４　ＤＮＡ的提取相　同。　１．２．２引物设计及合成　接，转化ＴＯＰ１０感受态细胞，涂布于含ｘ—ｇａ１．Ａｍｐ的　ＬＢ固体培养基上，３７％培养过夜，采用蓝白斑筛选　法挑选白色菌落，扩大培养，用日常型质粒ＤＮＡ小　量快速提取试剂盒提取质粒，将ＰＣＲ鉴定为阳性的　重组质粒送大连宝生物公司测序。测序结果用　ＤＮＡＳｔａｒ分析软件分析。　２　结果　２。１　ＰＧＲ的优化条件　对引物浓度、模板量、Ｍｇ２　浓度、变性时间、退　火温度和时问进行优化，确定最佳反应体系为：１０×　ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　５　Ｌ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣ］２　５　Ｌ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　参考ＧｅｎＢａｎｋ中鸭瘟病毒ＴＫ基因的核苷酸序　列（ＡｅｃｅｓＳｉｏｎ：ＡＹ９ｌ６３５６９），由大连宝生物公司设计并　ｄＮＴＰｓ　４　，上、下游引物（１０ｔｍａｏｌ／Ｌ）各２．５　，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／ｕＬ）０．２５ｔ￣Ｌ，模板２．５　，去离子水　２８．２５ｔ￣Ｌ；最佳反应条件为：９５￣Ｃ预变性５ｍｉｎ；９４￣Ｃ　合成了１对引物，引物序列如下：　上游：５　一ＴＣＡＣ１＇ＧＣＧＣＧＡＣＴＣ　ＧＡＡＣＧ一３　；　下游：５　一ＡＴｒＡＡＴｒＧＴＣＡＴＣＴＣＧＧＴＡ　ｒＴＧＴＡＴＴ一３　。　１．２．３　ＴＫ基因的扩增、克隆与序列测定　变性３０ｓ，５６％退火３０ｓ，７２￣Ｃ延伸３０ｓ，共４０个循环；　７２￣Ｃ延伸１０ｍｉｎ，于４ｏｃ结束反应。　２。２　ＴＫ基因的扩增　ＤＰＶ—Ｆ３４及Ｃ—ＫＣＥ均扩增出与预期基因（１０７７　ｂｐ）大小一致的片段（图１）。　对ＰＣＲ反应的几个主要因素：引物浓度、模板　量、Ｍｇ２　浓度、变性时间、退火温度和时间进行优　化，用优化的反应体系和条件进行ＰＣＲ反应，１％琼　脂糖凝胶电泳检测扩增产物。　２。３重组质粒的ＰＧＲ鉴定　以ＤＰＶ－Ｆ３４及Ｃ—ＫＣＥ的重组质粒为模板，均能　用３ｓ柱离心式琼脂糖ＤＮＡ小量快速纯化试剂　盒回收扩增产物，以Ｔ４　ＤＮＡ连接酶与ｐＢＳ—Ｔ载体连　Ｍ　１　２　３　４　扩增出与预期的基因大小符合的片段（图２）。　●　Ｍ：分子量标准；１：强毒株；２：疫苗株；３：无模板对照；４：ｄＨ２０　图１　ＤＰＶ　７１４基因扩增　Ｍ：分子量标准；ｌ：强毒株；２：疫苗株；３：无模板对照　图２重组质粒ＰＣＲ鉴定　２。４测序结果与同源性比较　测序结果表明：ＤＰＶ—Ｆ３４及Ｃ—ＫＣＥ的ＴＫ基因　ＤＱ６４０６１１、ＥＦ１７３４６４）相比，核苷酸同源性为９９．３％　～９９．９％，氨基酸的同源性也为９８．１％～９９．２％。　全长均为１０７７ｂｐ，编码３５８个氨基酸，ｃｃ含量分别　为４４．９％和４５．０％。二者核苷酸同源性为９９．４％，　ＤＰＶ—Ｆ３４与ＤＰＶ　Ｃ—ＫＣＥ的ＴＫ基因有６个核苷酸的　突变：２０６位由Ｃ—Ｔ，３９９位由Ｔ—Ｃ，６２０位由Ｇ—　Ａ，７２５位由Ｔ—Ａ，９２１位由Ｇ—Ａ，９４６位由Ａ—Ｇ。　推导的氨基酸同源性为９８．９％。核苷酸序列比对　结果和氨基酸序列比对结果见图３和图４。　ＤＰＶ—Ｆ３４及Ｃ—ＫＣＥ的ＴＫ基因与Ｇｅｎｂａｎｋ上登　推导的氨基酸有４个发生变化：６９位由　ａ—ｖａｌ，　２０７位由Ａｒｇ—Ｈｉｓ，２４２位由Ｐｈｅ—Ｔｙｒ，３１６位由Ｓｅｒ　录的鸭瘟病毒ＴＫ基因（ＡＹ９１１５０９、ＡＹ９６３５６９、　Ｇｌｖ。　维普资讯 http://www.cqvip.com

石河子大学学报（自然科学版）　ＤＰＶ－Ｆ３４　ＤＰｖ　Ｃ　ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ＿３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ－３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　ｃ＿ＫＣＥ　ＤＰＶ．Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ－３４　ＤＰＶ　ＧＫＣＥ　ＤＰｖ＿Ｆ－３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ．Ｆ＿３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ＿３４　ＤＰＶ　ｃ＿ＫＣＥ　ＤＰＶ　Ｆ３４　第２６卷　．Ａ１　ＴＣＡＣｒＧＣＣ￡ＧＡＣ１ｌ（　］　优ＧＡＡＣ唧●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●＿●●●●●●●●●●…●●●●●●●●●●●●’Ａ　ＡＴＣＣ￣，ＣＧＣ（　●●●●●●＿●●●●●＿●●●●●●　ＡＣＣ耵℃ＧＡＴ（　ＣＡＴｒＡＴＧＣ口１ＣＧＴＣＣＧＣＧＴＡＴＡＣＣｎ　ＧＡＣＧＧＧＣＣＧＴＡＴＧ　……●………●●…●…●●………●●…●……●…●●……●……●●…●…●●……　ＧＡＡＣ１℃　：　：ＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣ１　ＧＧＣＡＡＡＣ１’（　ｒｎ　……●●●…………………●…●●…●…………●…●…ＧＧＡＣＢＡＴＡＣＣＣｒＩＢＣＡ　………●…●……●…●●●　ＧＣＣＡＣ１ｌ（哪………●●……Ａ１　ｒＩ’ＧＣＣＧＡＧＣＣＡ　Ａ　…●＿………●……＿……：ＧＴＡＴｒＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＹＩＴＧＡ　●＿＿●………＿…＿＿＿＿＿…●●……………　ＡＧＡＴＧＣＡＡＴＡＡＡＯ［；ＧＣＧＴＡＴＡＣＧＡＡＡＣＡＣＡ０ＧＡＡＡＧＡ　Ａ　Ａ　Ａ０朗１ＣＧＡＧＧｌ　；　………　ｒ…………………………………………………………………・。　ＡＣＡＴＡＧＣＡＡＣＡＡＣ　ＩｍＣＧＣＡ　Ａ　Ａ　ＡＣ　：Ａ　ＡＴＴＡＣＧｒ（　ｒＧ（　ｒＩ１（：Ａ　ＡＣＴＧＣＡＡ　●…●●……●………●…●………●●●●●●…●………●●●●…●…●…●●………●●●　７７７７　……………（　…………………刀　…………●………………ＣＧＴｒＡＴＩ３Ｗ￣　……●………●　ＡＧＴＣＧＡＡＣ　．．………………ＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＡ３３ＧＡＴＣ　…………………………………………………・・Ｃ…　●●…　０ＧＣＡＣＣＣＧＡＣＣＧＣＣｏＣＡ　……………●●…●●●●…………Ｃ眦Ｉ…●…ＣＴＩ＇ＣＣＣＡＧＣＡＧＣ＂Ｉ＇ＣＧＴ１３ＴＧＴＡＧＴＧ　……●●…●…●●………●………０　…●●●●４　７岔４　…●●…●…●●…７７　，　…………∞　刀　…●………●●……，　７纾ＣＣＴＡＡＴｒＣＣＴＣＧ　………●……………●●　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ－Ｆ’３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰｖ＿Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ．ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　制（　………………………４　………●…●●…删　…………，７’俐……　７　●…………ＧＡＴＧＡＧＣ　……＿＿●●　Ａ　珊ＡＡＣＧＡＴｌ℃ＡＧＡＧＣｒＣａ：ＣＡＡＣＧＴＣＣ　；ＧＣＧＡＡＧＣＡ　Ａ１＿ＩＩＧＡＣＧＴＡ　ｃ７　……………∞∞　……………ｃＧⅨ４　・Ａ翻　刀　倒　拶　………………Ｃ　，　　………　Ａ…………………”………………………・　刀移　●………刀　Ｃ４　４ｏ｛　０　●…●…………………４　刷　………冗　删ｊ４　刃劂……………ＤＰＶ　Ｃ　ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ　ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ．Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ．Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰｖ＿Ｆ３４　册…………　………船　…・……………用　ＧＡＡＡ　ｄ，凹　Ａ………………………一……………一　ＧＡＡＧＣＧＣＧｒＧＡ１＿Ｉ℃ＡＧ　ｒＧＣＣｒＡ１］ｒＣＴｒ（　Ｉ觚…●…●●…●…●●…●…＿●…●＿●……●…●●●●●…●……Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　ＡＣＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣ　＿＿…●…●●……●………●●　ＡＴＣＡ　ＡＣＧＡＣｒ（Ｔａ盯１０ＴＣＡＣ　●●●●●●●●●●●●●●＿●●●＿●●●＿＿●●＿●●●●●●●●●●●●●●ＡＡＡＧＴＡＣＣ１℃ＡＡＣｒＡ　，Ｉ．ＧＡＣＧＡＡＴ　●●●●●●●●●●●●●●●●●＿＿＿＿＿＿●＿＿●●●●●●●●●●●●●●●●●　翻　●●●●●●●●●●●●●●●●●●＿●●●●●●●●●●●●●●●●●●豫４　４　●●●●●●●●●●●●●●●●●●删●●●●●　●●●●●●●●●●●●●●●，　●●●●●●刀　●●●　ＡＡＧ兀觚”…………ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ．Ｆ３４　ＯＧＡＴ兀℃Ａ　ＡＴＧＣＧＴＡＴ几　Ａｒｌ’ＧＧＡＣ　ＡＡＧ　；ＧＣＡＡＧＡＯＣＣＣ　Ａ…………………－－…………・Ｇ……・．．　………………・・ＣＣＡＡＧＡＧ，　ＩＧＣＣＧＣＩＢＡＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧＧＣ从ＣｒＡＡＣＧＣＧＡｒｌ℃ＧＡＣ丌ＴｒＡ　ＣＧＣＧＣＣｎ　ＴＩ　ＴＩＴＡＣＣＡＴＩ　●●●●●●＿●●●●＿●●●＿●●＿＿＿＿＿●●●●＿＿＿＿＿●●＿●ＣＧＧＧＧＡＴＩ　ｌＧＧＡＡＣＡＡＧＣＩ哪●●＿●＿●●＿●●●＿＿＿●●＿●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●ＡＡＣＣＡＡ　●●●●●●●●●●　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ　ＫＣＥ　姗　渤　姗　姗　彻　伽　姗　跚　黜　锄　种　Ｄ　Ｅ　（　７　４　刀　刀　姗　渤　咖　煳　５０　图３　ＤＰＶ　Ｆ３４和ＤＰＶＣ－ＫＣＥ　ＴＫ基因核苷酸序列比对结果　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＶＲＶＹＩＤＧＰＹＧ　Ｋｍ、吕ⅪＩＳＥ【ｙＩ　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＡＴＬＹＶＡＥＰＭＡＹＷＲＮＨＦＥＤＡＩＫＧＶＹＥＴＱＥＲＫＡＲＧＤＩＡＴＦＤＡＫＡ１ＴＡＡＬＱＬＱ　………………・・…………・１０ｏ　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　ＤＰＶ　Ｆ３４　ＤＰＶ　Ｃ　ＫＣＥ　ＤＰＶ。Ｆ３４　ＤＰＶ　ｃ＿ＫＣＥ　Ｖ………………・…………………………・・　ⅡＩｊＩＤＲＨ　ＡＡＣＬｃＦＰＡＡＲＦＶＶ　１５０　ＬＮＥＤＥＨＬＥＲＬＲＡＲＱＲＰＧＥＡＩＤＶ　ＲＨＢ　２０ｏ　ＡＫＱＡＰＩＭＷＤＣＤＫＷＤＫＤＷＳＳＶＰＩＦＤＤＤＲＫＫＭＬ　ＣＡＩ』　２＝５０　ＥＡＲＤＳ、　Ｖ　３０ｏ　ＤＰＶ　Ｆ－３４　ＤＰＶ　Ｃ。ＫＣＥ　Ｉ）ＩＷ。Ｆ３４　ＫＬＡＤＬＮＡＹＦＭＤＩＳＧＫＳＰＱＥＣＡＡＥＶＲＥＡＴＮＡＭＤ￣＇ＲＩＳＦＩ＇ＭＡＧ．ＤＬＥＱＡＶＮＱ　…………………３５０　Ｇ………………………………－……一………………　ＹＮ　ＩＥＭ　ｎＮ　ＤＰＶ　ＧＫＣＥ　图４　ＤＰＶ　Ｆ３４和ＤＰＶ　ＤＫｃＥ　ＴＫ基因氨基酸序列比对结果　维普资讯 http://www.cqvip.com 第１期　谢秀兰，等：鸭瘟病毒强、弱毒株　基因的克隆与序列测定　６７　３讨论　鸭瘟标准强毒株ＤＰＶ—Ｆ３４与鸭瘟鸡胚化弱毒株　Ｃ．ＫＣＥ的ＴＫ基因同源性很高，超过９９％，将其核苷　酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ中登录的鸭瘟病毒ＴＫ基因序列　进行比较，其同源性也超过了９９％。这说明了鸭瘟　因的克隆与序列分析［Ｊ］．青岛农业大学学报（自然科学　版），２００７，２４（３）：１６２—１６４．　［３］郭霄峰，廖　明，辛朝安，等．鸭瘟病毒北京株ＵＬ６和　ＵＬ７基因的克隆及序列测定［Ｊ］。畜牧兽医学报，２００２，３３　（６），６１５—６１８．　［４］王琳，杨润德，陈丽君，等。伪狂犬病病毒冀Ａ株　基因的克隆及序列分析［Ｊ］．动物医学进展，２００７，２８（４）：　２９－３３．　病毒　基因具有高度的保守性，这与李昌主等＿２ｊ　报道的鸭瘟病毒ＴＫ基因与已知各毒株高度保守相　一［５］张桂红，童光志，王柳，等。传染性鼻气管炎病毒ＴＫ基　因缺失株的构建［Ｊ］．中国预防兽医学报，１９９９，２１（４）：　２７５—２７７．　致。另外，本实验中ＤＰＶ．Ｆ３４与Ｃ—ＫＣＥ的ＴＫ基　因有６个单核苷酸变异，经与ＡＹ９１１５０９（鸭瘟弱毒　株）、ＡＹ９６３５６９（ＤＰＶ　Ｃｌｏｎｅ０３株）、ＤＱ６４０６１１（ＤＰＶ四　［６］吴德铭，罗满林，黄毓茂，等．伪狂犬病毒粤Ａ毒株　川株）、ＥＦ１７３４６４（鸭瘟强毒ＡＶ１２２１株）比较发现，鸭　瘟病毒强、弱毒株间单核苷酸的变异无规律，因而不　基因的扩增、克隆与序列测定［Ｊ］．华南农业大学兽医学　院，２００２，２３（３）：７１　７３．　同毒株问核苷酸的变异与ＤＰＶ的毒力差异关系不　大。　［７］陈建君，张毓金，杨增岐，等．鸭瘟病毒的分子生物学研　究进展［Ｊ］．动物医学进展，２００３，２４（６）：２５—８。２　［８］Ｋｉｔ　Ｓ，Ｋｉｔ　Ｍ，Ｐｉｒｔｌｅ　Ｅ　Ｃ．Ａｔｔｅｎｕｍｅｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉ—　ｎａｓｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ　ｏｆ　ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ　ｌ　Ｊ　Ｊ．ＡｍＪ　Ｖｅｔ　Ｒｅｓ，１９８５，４６：１３５９，１３６７．　疱疹病毒有２个活性中心，即位于Ｎ端的ＡＴＰ　结合结构域：ＤＧＰＹＧＴＧＫ和核苷酸结合结构域：ＤＲＨ　（图４中标有下划线的部分）。ＡＴＰ结合结构域形成　１个疏水的袋状构象，以便与ＡＴＰ腺嘌呤环结合，其　中的３个氨基酸残基（Ｇ）中的１个发生突变，则会影　［９］范伟兴，张雪莲，魏荣，等．含绿色荧光蛋白基因和猪　瘟Ｅ２基因的伪狂犬病毒Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１株ＴＫ基因缺失转　移载体的构建［Ｊ］．中国兽医杂志，２００３，３９（３）：３－８．　［１０］郭万柱，徐志文，王小玉，等．新型伪狂犬病病毒基因缺　失株的构建及生物学特征研究（初报）［Ｊ］．四川农业大　学学报，２０００，１８（１）：１－３．　响ＴＫ蛋白的构象及其与ＡＰＴ的结合，导致ＴＫ蛋白　功能丧失而致弱＿ｌ　＇ｌ　。对ＤＰＶ—Ｆ３４、ＤＰＶ　Ｃ．ＫＣＥ和　已知ＤＰＶ各毒株氨基酸序列分析表明，氨基酸的变　异并不在该区域内，因而其变异对其毒力的影响不　大　［１１］刘文波，周斌，黄兵，等．传染性喉气管炎病毒烟台　株ｉｒＫ基因序列测定及ＴＫ蛋白功能初步分析［Ｊ］．西农　林科技大学学报（自然科学版），２００５，３３（１０）：７５—７９．　［１２］宋得华，潘华奇，黎应胜，等．鸭瘟病毒ＴＫ基因及其编　参考文献：　［１］甘孟候．中国禽病学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９９：　１０９．１１９．　码蛋白的生物信息学分析［Ｊ］。安徽农业科学，２００７，３５　（３１）：９９３５—９９３６．　［２］李昌主，韩先杰，邹玲，等．鸭瘟病毒ＡＶ１２２１株　基　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｄｕｃｋ　Ｐｌａｇｕｅ　Ｖｉｒｕｓ　ＸＩＥ　Ｘｉｕ—ｌａｎ　，ＹＡＮＧ　Ｆａ．１ｏｎｇ　，ＬＩ　Ｙａｎｇ—ｙｏｕ３，ＹＵＥ　Ｈｕａ　（１　ＣｏＵｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｓｉｃｈｕａｎ　６１００４１，Ｃｈｉｎａ；　２　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ　６３７０００，Ｃｈｉｎａ；　３　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｍｅｄｉｃｌａ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ　６３７０００，Ｃｈｉａ）ｎ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＴＫ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｄｕｃｋ　ｐｌａｇｕｅ　ｖｉｅｓ　ａｖａｌｉｒａｂｌｅ　ｉｎ　ＧｅｎＢａｎｋａ　ｐａｉｒ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅ—　，ｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｉｆｅｄ　ｆｒｏｍ　ｂｏｔｈ　ＤＰＶ　ｓｔｎｄａｒｄ　ｖｉａｕｌｒｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎ（ＤＰＶ—Ｆ３４）ａｎｄ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　（Ｃ—ＫＣＥ）ｂｙ　ＰＣＲ．ｒｒｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｐＢＳ—Ｔ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄｌａｓｍｊｄｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ。Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＴＫ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ＤＰＶ—Ｆ３４　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　Ｃ—ＫＣＥ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｅｒｅ　１０７７ｂｐ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ　３５８　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ。Ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗａｓ　９９．４％ｉｎ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｅｅ　ａｎｄ　９８．９％ｉｎ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅＫｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｄｕｃｋ　ｐｌａｇｕｅ　ｖｉｒｅｓ；ＤＰＶ—Ｆ３４　ｓｔｒａｉｎ；Ｃ—ＫＣＥ　ｓｔｒａｉｎ；ＴＫ　ｇｅｎｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　。