1-苯基-2-硫脲对斑马鱼胚胎发育与黑色素生成的影响

２０１２年９月　中国比较医学杂志　ＣＨＩＮＥＳＥ　Ｊ０ＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１２　ＶｏＩ．２２　ＮＯ．９　第２２卷第９期　１一苯基一２一硫脲对斑马鱼胚胎发育与黑色素生成的影响　张利军，史慧勤，苑晓燕，余寿忠，赵　君，彭双清　（军事医学科学院疾病预防控制所毒理学评价研究中心，北京１０００７１）　【摘要】　目的度。方法１一苯基一２一硫脲（ＰＴＵ）可抑制斑马鱼胚胎黑色素的产生，保持斑马鱼透明，便于形态观察和信　号检测。本文研究了ＰＴＵ对斑马鱼胚胎发育的影响和抑制斑马鱼胚胎黑色素生成，保持斑马鱼透明性的最佳浓　用不同浓度ＰＴＵ处理２３　ｈｐｆ（受精后，ｈｏｕｒｓ　ｐｏｓｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｈｐｆ）斑马鱼胚胎，作用５７　ｈ后观察８０　ｈｐｆ斑　马鱼的形态学、生理学改变，计算死亡率和孵化率，测量心率和静脉窦一动脉球之间的距离。结果　浓度为０．１９７　ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２９６　ｍｍｏｌｆＬ　ＰＴＵ可以有效抑制黑色素生成，保持斑马鱼整体透明，对斑马鱼心血管系统结构和生理功　能无影响，且不影响斑马鱼正常孵化过程。随着ＰＴＵ浓度的增加，斑马鱼死亡率增加，孵化率下降，出现心包水肿，　心脏畸形等改变，心率下降，静脉窦一动脉球之间的距离增大。结论　浓度不高于０．２９６　ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＴＵ溶液能有　效抑制斑马鱼黑色素生成，对斑马鱼心血管毒性研究无影响。　【关键词】　１一苯基一２一硫脲；斑马鱼；心率；孵化率　【中图分类号】Ｒ９６５．１　Ｒ３３２　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７１—７８５６（２０１２）０９－００２１—０５　ｄｏｉ：１０．３９６９．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１．７８５６．２０１２．００９．００５　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ａｎｄ　Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　１－ｐｈｅｎｙｌ　２－ｔｈｉｏｕｒｅａ（ＰＴＵ）　ｉｎ　Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　Ｅｍｂｒｙｏｓ　ＺＨＡＮＧ　Ｌｉ—ｊｕｎ，ＳＨＩ　Ｈｕｉ—ｑｉｎ，ＹＵＡＮ　Ｘｉａｏ—ｙａｎ，ＹＵ　Ｓｈｏｕ—ｚｈｏｎｇ，ＺＨＡＯ　Ｊｕｎ，ＰＥＮＧ　Ｓｈｕａｎｇ—ｑｉｎｇ　（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００７　１，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，ｅｍｂｒｙｏｓ　ｍａｙ　ｂｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　１一ｐｈｅｎｙｌ　２一ｔｈｉｏｕｒｅａ　（ＰＴＵ）ｔｏ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｗｈｅｎ　ｗｏｒｋｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ　ｉｎ　ｔｅｌｅｏｓｔｓ，ｓｉｇｎａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍａｙ　ｂｅ　ａｇｇｒａｖａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｈｅｒｅ　ｗｅ　ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＰＴＵ　ｏｎ　ｅｍｂｒｙｏ，ａｎｄ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ　ａｎ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｕｓｉｎｇ　ＰＴＵ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｅｍｂｒｙｏｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　２３　ｈｐｆ（ｈｏｕｒｓ　ｐｏｓｔ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｅｒｉａｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＰＴＵ．　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｉｅｄ　ｆｆｏｒ　ｕｎｅｘｐｏｓｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｐｏｓｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，　ｈｅａｒｔ　ｒａｔｅ，ｈａｔｃｈｉｎｇ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ＳＶ—ＢＡ　ｄｉｓｔａｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｕｎｔｉｌ　８０　ｈｐｆ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　０．１９７ｍｍｏｌ／Ｌ　ａｎｄ　０．２９６　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＴＵ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｗｈｉｌｅ　ａｖｏｉｄｉｎｇ　ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ｗｉｔｈ　ｅｍｂｒｙｏ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，ｔｅｒａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｄｕｃｅｄ　ｈａｔｃｈｉｎｇ￣ｅｑｕｅｎｃｙ，ａｎｄ　ｈｅａｒｔ　ｒａｔｅ．Ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ＰＴＵ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｈａｔｃｈｉｎｇ￣ｅｑｕｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｗｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ　ａｎｄ　ｙｏｌｋ　ｓａｃ　ｅｄｅｍａ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｃａｎ　ａｃｈｉｅｖｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｗｈｉｌｅ　ａｖｏｉｄｉｎｇ　ｔｏｘｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ＰＴＵ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　１一ｐｈｅｎｙｌ一２一ｔｈｉｏｕｒｅａ（ＰＴＵ）；Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ；Ｈｅａｔｒ　ｒａｔｅ；Ｈａｔｃｈｉｎｇ　ｒａｔｅ　［基金项目］国家“重大新药创制”科技重大专项（２００９ＺＸ０９５０１－０３４）；国家９７３计划（２０１１ＣＢ５０３８０３）。　［作者简介］张利军，男，博士生，研究方向：药物安全性评价。　［通讯作者］彭双清，研究员，博士生导师，研究方向：药物安全性评价；Ｅｍａｉｌ：ｐｅｎｇｓｑ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。　２２　中国比较医学杂志２０１２年９月第２２卷第９期Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃｏｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１２，Ｖｏ１．２２．Ｎｏ．９　斑马鱼（Ｄａｎｉｏ　ｒｅｒｉｏ）作为一种新型脊椎模式生　物已被广泛应用于毒理学研究。斑马鱼易饲养，繁　殖能力强，斑马鱼胚胎透明，生长发育快，施药方式　简单¨　。斑马鱼胚胎在发育早期，即使心血管系统　有缺陷，也可以依靠溶解氧继续发育。目前，斑马　鱼已成为ＯＥＣＤ和ＩＳＯ毒性试验的推荐测试物　种　。斑马鱼胚胎透明，发育到２４　ｈ左右则开始　出现黑色素，黑色素细胞会影响基因表达信号、绿　色荧光蛋白信号、整体原位杂交信号检测。因此，　需要对斑马鱼胚胎进行处理，抑制黑色素生成，保　持其透明性。研究表明在斑马鱼原肠胚期（５．５　ｈｐｆ）后使用ＰＴＵ溶液代替养鱼用水，能有效抑制黑　色素生成，保持斑马鱼透明性，但ＰＴｕ也具有毒性　作用，高浓度ＰＴＵ可影响斑马鱼孵化率，甚至产生　致畸和致死效应　。本文研究不同浓度ＰＴＵ对斑　马鱼胚胎发育的影响，为运用斑马鱼进行心血管毒　性评价研究时选择合适浓度ＰＴＵ提供参考资料。　１材料和方法　１．１实验动物　实验所用斑马鱼为ＡＢ系斑马鱼，由北京大学　生命科学院惠赠，本实验室繁殖。斑马鱼的养殖和　繁殖参照标准的方法　。雌雄斑马鱼成鱼分开饲　养于爱生斑马鱼养殖系统中。水温保持在２８．５±　１　ｏＣ，盐度为４５０～５００　ｍＳ／ｃｍ　，ｐＨ为７．５～８．５，光　照周期为照明ｌ４　ｈ／黑暗１０　ｈ交替进行，每日喂２　次活丰年虾。采卵时，首日傍晚按雌雄１：１的比例　将健康斑马鱼成鱼放入交配缸内，次日清晨获得受　精卵。对受精卵进行清洗后，移人斑马鱼胚胎培养　用水（６０　ｍｇ／ｍＬ海盐）中，２８．５℃恒温培养箱中　培养。　１．２受试药物　１－苯基一２一硫脲（ＰＴＵ）购自ｓｉｇｍａ公司。将ＰＴＵ　粉末溶于０．３×Ｄａｎｉｅａｕ（１７　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣ１，２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣ１，０．１２　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＳＯ４，１．８　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｃａ（ＮＯ３）２，　１．５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＳ，ｐＨ７．６）培养液中，配制成０．１９７　ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２９６　ｍｍｏｌ／Ｌ、０．７４２　ｍｍｏｌ／Ｌ、１．４８　ｍｍｏｌ／Ｌ、２．９６　ｍｍｏｌ／Ｌ、７．３９　ｍｍｏｌ／Ｌ浓度的ＰＴＵ试　验液。　１．３处理胚胎方法　在Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＳＺＸ１０型体视显微镜下选择发育至　２３　ｈｐｆ（２８体节期）的野生型ＡＢ系斑马鱼胚胎，按　照随机分配原则，每浓度３０枚胚胎，加入相应浓度　ＰＴＵ。对照组为胚胎培养用水。随后加盖封闭，置　于２８．５℃恒温光照培养箱内，让胚胎继续发育。待　斑马鱼发育至８０　ｈｐｆ进行观察、拍照。此刻，未暴露　斑马鱼胚胎已都孵化成幼鱼　。试验过程中，每２４　ｈ更换１次ＰＴＵ溶液。　１．４死亡率与孵化率计算　每天观察１次斑马鱼胚胎死亡、存活情况，并详　细记录，将死亡胚胎和幼鱼移去。斑马鱼发育至８０　ｈｐｆ，计算累积死亡率百分率，可根据艾博特（Ａｂｂｏｔｔ　Ｓ）公式用对照组的死亡率进行校正　：　Ｐ＝１００＿［（Ｃ—Ｐ　）／Ｃ×１００］　Ｐ——已校正的存活百分率，％；　Ｐ　——试验浓度组中所观察到的存活百　分率，％；　ｃ——对照组中的存活百分率，％。　斑马鱼胚胎从４８　ｈ开始孵化，胚胎躯体全部　（从头到尾）从绒毛膜内出来，认为斑马鱼由胚胎孵　化为幼鱼。斑马鱼发育到８０　ｈｐｆ，基本全部孵化　。　因此，我们从４８　ｈｐｆ定时观察孵化情况，８０　ｈｐｆ统计　各组斑马鱼孵化率。　１．５形态观察　Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＳＺＸ１０型体视显微镜下每日观察ＰＴＵ　对斑马鱼的影响，观察的毒性终点包括：心包和卵　黄囊水肿、出血、畸形等。　１．６心率测量　斑马鱼发育至８０　ｈｐｆ，从各处理组和对照组随　机选择５条斑马鱼，在用显微摄像系统（３４０Ｍ．００．　ＧＥ，ＤＶＣ　Ｃｏ．，ＵＳＡ）对斑马鱼心跳摄像３０　Ｓ。使用　Ｉｍａｇｅ　Ｊ软件对斑马鱼心跳录像进行分析，统计　心率　。。。　１．７　静脉窦（ｓｉｎｕｓ　ｖｅｎｏｕｓ）与动脉球（ｂｕｉｂｕｓ　ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ）距离测量　斑马鱼心脏发育基本在最初２　ｄ完成。３０　ｈｐｆ　形成心室和心房，３６　ｈｐｆ心脏发生向右环化　，使　得心房、心室在侧面观上部分重叠，心室在心房的　右前侧。心脏发育过程受到影响，心房和心室的位　置将发生改变，静脉窦（血液进入斑马鱼心脏的部　位）和动脉球（血液流出斑马鱼心脏的部位）之间的　距离相应发生改变，两者之间的距离是评价心脏环　化程度的指标，通过测量静脉窦与动脉球之间的距　离可量化评价药物对斑马鱼心脏影响程度　。　１．８统计分析　应用统计软件ＳＰＳＳ１１．５处理数据，结果以面±Ｓ　中国比较医学杂志２０１２年９月第２２卷第９期　Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃａｍｐ　Ｍｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１２，Ｖｏ１．２２．Ｎｏ．９　２５　孵化，降低孵化率和延迟孵化　。孵化率是评价化　合物对斑马鱼是否产生毒性作用的一个敏感指标。　我们发现浓度高于０．７４２　ｍｍｏｌ／Ｌ的ＰＴＵ可对斑马　Ｓｔａｇｅｓ（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　２１２），１９９８，１—２０．　［４］　ＩＳＯ．Ｗａｔｅｒ　Ｑｕａｌｉｔｙ—Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｏ　Ｅｍｂ￣ｏｓ　ａｎｄ　Ｌａｒｖａｅ　ｏｆ　Ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ　Ｆｉｓｈ－－Ｓｅｍｉ—Ｓｔａｔｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ，１９９９，１２８９０，１　１４．　鱼胚胎产生毒性作用，降低其孵化率。　高浓度的ＰＴＵ不仅影响斑马鱼心脏功能，还影　响斑马鱼心脏发育过程，产生器质性损害，引起心　包水肿等畸形，心脏环化不全，表现为ＳＶ与ＢＡ之　间的距离明显增长。我们研究发现０．１９７　ｍｍｏｌ／Ｌ、　０．２９６　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＴＵ对斑马鱼心脏形态和功能不产　ｌｓｓｏｎ　Ｊ，ｙｏｎ　Ｈｏｆｓｔｅｎ　Ｊ，Ｏｌｓｓｏｎ　ＰＥ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ　［５］　Ｋａｒｚｅｂｒａｆｉｓｈ：ａ　ｒｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｅｍｂ￣ｏｎｉｃ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｍａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（ＮＹ），２００１，３（６）：５２２—５２７．　ｅｒｆｉｅｌｄ　Ｍ．Ｔｈｅ　Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　Ｂｏｏｋ［Ｍ］．Ｏｒｅｇｏｎ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　［６］　ＷｅｓｔＯｒｅｇｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，２００７．　［７］　Ｈｉｓａｏｋａ　Ｋ．Ｋ，Ｂａｔｔｌｅ　ＨＩ．Ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｓｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　生任何影响，不影响斑马鱼胚胎心脏发育过程和孵　化过程，能很好抑制斑马鱼黑色素生成，保持斑马　鱼透明性。Ｋａｒｌｓｓｏｎ等　报道７５　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＴＵ可抑　制黑色素生成，且对斑马鱼胚胎结构和孵化率无影　响，但该浓度并未被其他研究人员接受。可能是该　浓度只能完全抑制３６　ｈ前斑马鱼黑色素生成，并　不能完全抑制３６　ｈ后斑马鱼黑色素生成　。我们　从斑马鱼心血管系统的结构和功能两方面研究ＰＴＵ　的心血管毒性作用，发现使用的ＰＴＵ浓度虽然比文　献报道的浓度要高，但对斑马鱼的结构和生理功能　没有影响，且能有效保持发育至８０　ｈｐｆ斑马鱼胚胎　的透明性。所以，我们认为在斑马鱼心血管毒性试　验中可以选择低于０．２９６　ｍｍｏｌ／Ｌ浓度的ＰＴＵ抑制　斑马鱼黑色素的生成，且对实验结果不会产生影　响。因此，在保证ＰＴＵ对斑马鱼心血管系统无毒性　影响的前提下，可以选择合适的ＰＴＵ浓度，以保证　抑制黑色素生成的效果。　致谢：感谢中国医学科学院生物技术研究所张　靖溥老师提供ＤＶＣ显微摄像系统。　参考文献　［１］　Ｐｈｅｌｐｓ　ＨＡ，Ｎｅｅｌｙ　ＭＮ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｍｏｄｅｌ：ｆｒｏｍ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］・Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，　２００５，２（２）：８７—１０３．　［２］　ＯＥＣＤ．Ｆｉｓｈ，Ｅａｒｌｙ　Ｌｉｆｅ　Ｓｔａｇｅ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｔｅｓｔ（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　２１０）．　１９９２，１—１８．　［３］　ＯＥＣＤ．Ｆｉｓｈ，Ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｔｅｓｔ　ｏｎ　Ｅｍｂ￣ｏ　ａｎｄ　Ｓａｃ－ｆｒｙ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ，ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ　ｒｅｒｉｏ（ｈａｍｉｌｔｏｎ—ｂｕｃｈａｎａｎ）［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，１９５８，１０２（２）：３１１—３２７．　［８］　中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准　化管理委员会．化学品鱼类胚胎和卵黄囊仔鱼阶段的短期毒　性试验［Ｍ］，北京：中国标准出版社，２００８，１—１３．　［９］　Ｆｒａｙｓｓｅ　Ｂ，Ｍｏｎｓ　Ｒ，Ｇａｒｒｉｃ　Ｊ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　４－ｄａｙ　ｅｍｂ￣ｏ－ｌａｒｖａｌ　ｂｉｏａｓｓａｙ　ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ［Ｊ］．　Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｓａｆ，２００６，６３（２）：２５３—２６７．　［１０］　佟军威，张靖溥，孟杰．１７ａ一乙炔雌二醇对斑马鱼胚胎发育　的致畸作用及其基因靶位［Ｊ］．药学学报，２０１１，４６（１）：５０—　５７．　［１１］　Ｓｔａｉｎｉｅｒ　ＤＹ．Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　ｈｅａｒｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ，２００１，２（１）：３９—４８．　［１２］　Ｌｉｎ　ＣＣ，Ｈｕｔ　ＭＮ，Ｃｈｅｎｇ　ＳＨ．Ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃａｒｂａｒｙｌ　ｉｎ　ｅａｒｌｙ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ　ｒｅｒｉｏ）ｅｍｂ￣ｏｓ［Ｊ］．　Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００７，２２２（２）：１５９—１６８．　［１３］　Ｋｅｌｓｈ　ＲＮ，Ｂｒａｎｄ　Ｍ，Ｊｉａｎｇ　ＹＪ，ｅｔ　ａ１．Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒａｌ　ｃｒｅｓｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９６，１２３：３６９—３８９．　［１４］　Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　ＪＲ．Ａｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｐｉｇｍｅｎｔ　ｃｅｉｌｓ　ｏｆ　ａｓｃｉｄｉａｎ　ｅｍｂ￣ｏｓ［Ｊ］．Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ，１９６６，１４（１）：１　３９．　［１５］　Ｃｏｎｔａｒｄｏ—Ｊａｒａ　Ｖ，Ｐｆｌｕｇｍａｃｈｅｒ　Ｓ，Ｎｕｔｚｍａｎｎ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．Ｔｈｅ　ｂｅｔａ－　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｌｏｃｋｅｒ　ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ　ａｌｔｅｒｓ　ｄｅｔｏｘｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｏｎ—ｔａｒｇｅｔ　ｏｒｇａｎｉｓｍ　Ｄｒｅｉｓｓｅｎａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｐｏｌｌｕｔ，　２０１０，１５８（６）：２０５９—２０６６．　１６　孙桂金，潘杰，刘可春，等．苯硫脲对斑马鱼黑色素生成及早　期发育的影响［Ｊ］．水产科学，２０１１，３０（７）：３８７—３９０．　［修回日期］２０１２－０８．２５