蛋白质羰基含量检测试剂盒说明书 微量法

北京索莱宝科技有限公司蛋白质羰基含量检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号：BC1275规格：100T/48S产品内容：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。试剂一：粉剂0.1g×5支，4℃保存。（使用前根据样品数，每支加1mL水震荡溶解后离心取上清使用，每支为10个样品用量）试剂二：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存。试剂四：液体15mL×1瓶，4℃保存。试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。（自备）试剂六：液体30mL×1瓶，4℃保存。产品说明：蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。羰基与2,4-二硝基苯肼反应生成红色2,4-二硝基苯腙，在370nm处有特征吸收峰。自备实验用品及仪器：天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。操作步骤：一、样品处理：组织样品：称取约0.1g组织样品，加入1mL提取液，充分匀浆后于4℃，5000rpm离心10min，取上清，第1页，共3页北京索莱宝科技有限公司加入0.1mL试剂一，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，取上清，然后取20μL测定蛋白含量，剩余的作为待测样品。二、测定步骤和操作表：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至370nm，试剂六调零。2、操作表对照管样品（μL）试剂二（μL）试剂三（μL）120混匀，37℃避光反应1h试剂四（μL）15015060测定管60120静置5min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，留沉淀试剂五（μL）300300漩涡混匀，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀。重复3次。试剂六（μL）300300漩涡混匀，37℃温育15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000rpm离心15min，取上清200μL，微量石英比色皿/96孔板，试剂六调零，测定OD370。三、计算公式：a)用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、按蛋白浓度计算：蛋白质羰基含量（μmol/mgprot）=（OD370测定管－OD370对照管）÷（ε×d）×V÷(Cpr×V样品)=（OD370测定管－OD370对照管）÷4.4÷Cpr2、按样本鲜重计算：蛋白质羰基含量（μmol/g鲜重）=（OD370测定管－OD370对照管）÷（ε×d）×V÷(W×V样品÷V提取)=（OD370测定管－OD370对照管）÷4÷Wε：蛋白质羰基消光系数，22mL/μmol/cm：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.06mL；第2页，共3页V：加入试剂六体积，0.3mL；V提取：加入提取液及试剂一体积，1.1mL；北京索莱宝科技有限公司Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；b)用96孔UV板测定的计算公式如下：d：光径，0.6cm。W：样品质量，g。注意事项：1.试剂一使用前根据要测定的样品数现配，配置好后4℃保存，若变为黑色，则不能使用。2.试剂二见光易分解，反应需严格避光。第3页，共3页