响应面法优化多杀菌素发酵条件

食品与发酵科技　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　第４７卷（第４期）Ｖｏ１．４７，Ｎｏ．４　响应面法优化多杀菌素发酵条件　杨睿智　，郭义东　（１．四川大学化学工程学院，四川成都６１００４１；２．抗生素研究与再评价四川省重点实验室，中国医药集团总公司四Ｊ　抗菌素工业研究所，四川成都６１００５２）　摘要：采用响应面分析法对多杀菌素发酵条件进行优化。通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计实验，从培养基中筛选出显著　影响因子：葡萄糖，糊精和干燥酵母粉；进行最陡爬坡实验，选出最佳响应区域；然后采用中心组合设计，对三个显著　影响因素进一步的优化，得到最佳的培养条件：葡萄糖４１．９８ｇ／Ｌ，糊精１３．６ｇ／Ｌ，干燥酵母粉３．１ｇ／Ｌ，棉籽粉２０ｇ／Ｌ，鱼　粉ｌＯｇ／Ｌ．硫酸铵１．５ｇ／Ｌ，硫酸镁Ｏ．１ｇ／Ｌ，，碳酸钙３　ｇ／Ｌ，接种量１０％，初始ｐＨ　７．０，转速２２０ｒ／ｍｉｎ，发酵培养时间７ｄ。　在此条件下，多杀菌素的产量提高了６９．７８％。　关键词：多杀菌素；响应面分析法；优化　中图分类号：ＴＱ９２０．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７４—５０６Ｘ（２０１１）０４—００８５—０００５　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｐｉｎｏｓａｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＹＡＮＧ　Ｒｕｉ—ｚｈｉ　一．ＧＵ０　Ｙｉ－ｄｏｎｇ　（Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｃｏｌｌｅｇｅ．Ａ　ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｒｅ－ｐｒｏｉｌｆｉｎｇ　Ｋｅｙ　ｎ６　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＡ　ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　Ｃｈｉｎａ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｈａｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｇｒｏｕｐ　Ｃｏｒｐｏｒｔｉａｏｎ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００５２）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｉｆａｅｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｉｍｐａｃｔ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｇｌｕｃｏｓｅ，ｄｅｘｔｉｎ　ａｎｄ　Ｅｂｉｒｏｓ，ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ａｎｄ　ｉｄｅｎｔｉｉｆｅｄ　ｂｙ　Ｐｌａｃｋｅｅｔ—　Ｂｕｒｍａｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｇｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｒｅａ，ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｓｔｅｅｐｅｓｔ　Ａｓｃｅｎｔ　Ｐａｔｈ　Ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗａｓ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：ｇｌｕｃｏｓｅ　４１．９８ｇ／Ｌ，ｄｅｘｔｉｒｎ　１３．６ｇ／Ｌ，ＰＭＭ　２０ｇ／Ｌ，Ｅｂｉｏｓ　３．１　ｇ／Ｌ，ｆｉｓｈ　ｍｅａｌ　ｌＯｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４　１．５ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４　０．１ｇ／Ｌ，ＣａＣ０３　３ｇ／Ｌ　ａｎｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐＨ　ａｄｊｕｓｔｅｄ　ｔｏ　７．０：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：ｓｈａｋｅｒ　ｓｐｅｅｄ　２２０　ｒ／ｍｉｎ；ｉｎｏｃｕｌｕｍ　ｓｉｚｅ　ｌＯ％ｖ／ｖ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｆ０ｒ　７　ｄａｙｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｉｌｅｒ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｈａｋｅ－ｆｌａｓｋ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｂｙ　６９．７８％ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖｉｏｕｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｐｉｎｏｓａｄ；ｐｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７４—５０６Ｘ．２０１　１．０４—０２３　多杀菌素（Ｓｐｉｎｏｓａｄ），又名刺糖菌素，是放线菌刺　糖多孢菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ）有氧发酵的胞内　次级代谢产物，其活性成分为多杀菌素Ａ（ｓｐｉｎｏｓｙｎ　Ａ）和多杀菌素Ｄ　Ｐｉｎｏｓｙｎ　Ｄ）Ⅲ，均为大环内酯类化　合物闭，结构式如图ｌ。多杀菌素具有独特的作用机　棉铃虫、甜菜夜蛾等，对一些消耗大量枝叶的直翅　目、鞘翅目害虫也有效果，并表现出极高的毒性　［５１，　而对大多数益虫［６１、水生动物［７］和哺乳动物［８］毒性很　低。因其具有杀虫谱广、活性高、对非靶标动物无害　和分解产物安全等优点，并于１９９９年获得美国“总　统绿色化学品挑战奖（Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔｉａｌ　Ｇｒｅｅｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　理嘲，主要用于防治鳞翅目害虫，能有效防治小菜蛾、　收稿日期：２０１１－０５—１８　基金项目：科技基础条件平台项目（Ｎｏ．２００５ＤＫＡ２１２０３）；抗生素研究与再评价￣ｔ　Ｊ＇ｌ重点实验室开放基金（Ｎｏ．２００９ＪＣ００４）。　作者简介：杨睿智（１９８３一），男，在读研究生，从事微生物新药筛选工作。　食品与发酵科技　２０１１年第４期　Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　”１９１ｏ　Ｃ　ｌ　Ｈ３Ｃ／Ｎ　ｓｐｉｎｏｓｙｎ　Ａ：Ｒ＝Ｈ　Ｒ　ｓｐｉｎｏｓｙｎ　Ｄ：Ｒ＝ＣＨ３　图１多杀菌素　Ｆｉｇ．１　Ｓｐｉｎｏｓａｄ　响应面法（Ｒｅｓｐｏｎｓ　ｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ，简称　ＲＳＭ）是由Ｂｏｘ等人于２０世纪５０年代提出的，是数　学和统计学结合的产物，通过实验得到的数据，建立　连续变量曲面模型，采用多元二次回归方程来拟合因　素与响应值之间的关系，对影响产量的各因子水平及　其交互作用进行优化与评价的方法，可快速有效地确　定多因子系统的最佳条件。目前，国内已报道了许多　运用响应面法对培养基条件等进行优化［１０－１３】，达到　提高产量的研究。随着ＳＡＳ，Ｍｉｎｉｔａｂ，Ｄｅｓｉｇｎ—Ｅｘｐｅｒｔ　等软件的不断开发，并在微生物优化实验中　１的使　用，更加进一步的推动了响应面分析法在各领域中　的应用。　本文利用响应面分析法对多杀菌素发酵培养　基、初始ｐＨ及接种量等发酵条件进行了优化，优化　后配方的发酵结果较原配方的发酵结果有大幅度的　提高。　１材料与方法　１．１菌种　刺糖多孢菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ）ＳＩＩＡ—　Ｙ１６０１８，由四川Ｉ抗菌素工业研究所微生物资源中心　提供。　１－２培养基　斜面培养基酵母浸粉４ｇ／Ｌ，麦芽糖浸粉ｌＯｇ／Ｌ，　葡萄糖４ｇ／Ｌ，琼脂１８ｇ／Ｌ，ｐＨ　７－３　种子培养基可溶性淀粉２５ｇ／Ｌ，葡萄糖ｌＯｇ／Ｌ，　鱼粉５ｇ／Ｌ，棉籽粉３ｇ／Ｌ，ＮＺ—ｃａｓｅ　３ｇ／Ｌ，酵母浸粉２ｇ，ＩＪ，　碳酸钙２ｇ／Ｌ，ｐＨ自然　初始发酵培养基葡萄糖ｌＯｇ／Ｌ，糊精２５ｇ／Ｌ，燕　麦２０ｇ／Ｌ，棉籽粉１０ｇ／Ｌ，鱼粉５ｇ／Ｌ，糖蜜５ｇ／Ｌ，干燥酵　母粉２ｇ／Ｌ，碳酸钙５ｇ／Ｌ，ｐＨ　７．０　１．３培养方法　（１）菌种活化和种子培养　将４℃保藏的冻干管菌种接种到新鲜斜面上，　２８℃生化培养箱中培养１０ｄ～１４ｄ；取斜面活化菌种　接入种子培养基中，在２８℃温度下２２０ｒ／ｍｉｎ摇床中　振荡培养７２ｈ。　（２）发酵培养　取种子培养液以１０％的接种量接人摇瓶中，在　２８℃温度下２２０ｒ／ｍｉｎ摇床中振荡培养７ｄ，每个样品　做５个平行样，结果取平均值。　摇瓶培养实验的装液量均为２５ｍＬ的培养基　于２５０ｍｌ的锥形瓶中。　１．４产物检测方法　取５．ＯｒａＬ同批发酵液，加入５．０ｍＬ甲醇，充分振　荡，室温浸提２ｈ；４０００ｒ／ｍｉｎ离心５分钟，取上清液再　进行高速离心（１２０００ｒ／ｍｉｎ）后进行高效液相色谱分　析（ＨＰＬＣ）。色谱柱为Ｄｉｋｍａ　Ｃ１８（２５０ｒａｍｘ４．６ｍ，　５　ｍ），检测波长２４５ｎｍ，流动相为甲醇：乙腈：乙酸铵　水溶液（０．０５ｍｏｌ／Ｌ）＝４４：４８：８（ｖ／ｖ），流速１ｍｌ／ｍｉｎ，柱　温：３０。【＝；进样量：ｌＯｌｘＬ　１．５优化试验设计　１．５．１　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ筛选实验　根据实验室前期实验研究结果，本实验选取１０　个因素作为研究对象，每组实验５次重复，取５次实　验平均值。Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验设计表格选用１Ｏ　因素、Ｎ＝１２次的实验表格。选取的影响因子及编码　见表１。运用软件对实验结果进行分析，比较各因素　对多杀菌素生长的影响。　表１　Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ筛选实验中各因素的水平　Ｔａｂ．１　Ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｖａｒｉａｂｌｅｓ　ｉｎ　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　１．５．２最陡爬坡实验设计（Ｓｔｅｅｐｅｓｔ　Ａｓｃｅｎｔ　Ｐａｔｈ　Ｄｅｓｉｇｎ）　根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ－－Ｂｕｒｍａｎ实验结果，以及各个显　著影响因素效应的大小设定步长及变化方向进行实　验。针对葡萄糖、糊精、酵母粉３个因素进行最陡爬　坡实验，其中葡萄糖为正效应，糊精和酵母粉为负效　第４７卷（是第１６４期）　杨睿智等：响应面法优化多杀菌素发酵条件　８７　应，将前者的值逐步增加，后两者的值逐步减小，设　计实验找出峰值，以寻找快速最佳的响应区域。　１．５．３中心组合设计（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｄｅｓｉｇｎ）　根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验和爬坡实验确定的　实验因素与水平，应用中心组合设计（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｃｏｒｎ—　ｐｏｓｉｔｅ　Ｄｅｓｉｎｇ，ＣＣＤ）法对多杀菌素培养基进行进一　步研究。上述每个实验均进行５次平行实验，对应的　响应值取５次实验结果的平均值。实际考察的变量　及其实验水平编码见表２。　表２中心组合设计各因素及其水平　Ｔａｂ．２　Ｌｅｖｅｌ　ａｎｄ　ｃｏｄｅ　ｏｆ　ｖａｒｉａｂｌｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｅｎｔｅａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　２结果与分析　２．１　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－－Ｂｕｒｍａｎ筛选实验　按照】．５．１的实验设计方法考察葡萄糖（Ｘ　），糊　精（Ｘ２），棉籽粉（Ｘ３），酵母粉（ｘ４），鱼粉（Ｘｓ），硫酸铵（ｘ６），　硫酸镁（Ｘ７），接种量（ｘ８），碳酸钙（ｘ９），ｐＨ（Ｘ　ｏ）１０个因　素对多杀菌素产量的影响。ＰＢ实验设计及结果（相　对于初始发酵培养基的效价，相对效价：ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｉｔｅｒ）见表３，用统计分析软件对实验结果进行分析，　各因素所代表的参数、水平及因素效应评价见表４。　表３　Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ筛选实验的实验结果　Ｔａｂ．３　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＰＩａｃｋｅｔｌ—Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　从表４可以看出，在多杀菌素的发酵生产中，　ｘ　、Ｘ：和Ｘ　是主要的影响因素，在９５％的概率水平　上影响显著。ｘ　、Ｘ　、Ｘ　和Ｘ　。的影响为负效应，应当　取其低水平；Ｘ　、Ｘ　和Ｘｓ的影响为正效应，取其高水　平。因此根据ＰＢ实验结果可以初步确定非显著影　表４　Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ筛选实验的结果分析　Ｔａｂ．４　Ｅｆｆｅｃｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｐｌａｃｋｅ￣一Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ　响因素的水平：即棉籽粉２０ｇ／Ｌ，鱼粉１０ｇ／Ｌ，硫酸铵　１．５ｇ／Ｌ，硫酸镁０．１ｇ／Ｌ，接种量１０％，碳酸钙３ｇ／Ｌ，初　始ｐＨ　７．０。　对培养基优化时，过去较多采用单因素法或者　正交设计法，这些方法不但费时费力，且容易忽略因　子间的相互交互作用而得出不准确的结论，因此影　响实验结果，使实验实现不了真正的最优化。而ＰＢ　设计法，是一种近饱和的２水平实验设计方法，能用　最少实验次数估计因素的主效应，从众多的考察因　素中较为快速有效地筛选出最为重要的几个因素供　进一步研究。　２．２最陡爬坡实验　响应面拟合只有在邻近最大响应区域后才能最　好地反映出真实情况，故要先逼近最佳相应区域，以　Ｐｌａｅｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验结果为基础，针对葡萄糖（Ｘ。）、　糊精（ｘ２）、酵母粉（Ｘ４）３个因素设计最陡爬坡实验，其　中葡萄糖为正效应，糊精和酵母粉为负效应，将前者　的值逐步增加，后两者的值逐步减小，找出峰值，以　寻找快速最佳的响应区域。实验设计和结果（相对于　初始发酵培养基的效价，相对效价：ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｉｔｅｒ）￣［１　表５所示。　表５最陡爬坡实验的实验设计及实验结果　Ｔａｂ．５　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　Ｓｔｅｅｐｅｓｔ　Ａｓｃｅｎｔ　Ｐａｔｈ　Ｄｅｓｉｇｎ　８８　食品与发酵科技　２０１１年第４期　由最陡爬坡实验可知：在葡萄糖４２　Ｌ，糊精　表７多杀菌素产量二次多项模型及其各项的方差分析表　Ｔａｂｌ７　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｑｕａｄｒａｔｉｃ　ｍｏｄｅｌ　１４　Ｌ和酵母粉３．２　Ｌ的条件下，多杀菌素的产量最　高，相对效价达到１６９．７２％。因此设定葡萄糖４２ｇ／Ｌ，　糊精１４　Ｌ和酵母粉３．２　Ｌ为响应面优化法实验的　中心点，据此设计响应面优化实验。　２．３中心组合实验设计及结果　根据Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ实验和爬坡实验确定的　实验因素与水平，中心组合设计（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｄｅｓｉｇｎ，ＣＣＤ）法对多杀菌素培养基进行进一步研究。　上述每个实验均进行５次，对应的响应值取５次实　验结果的平均值。实验设计及结果（相对于初始发酵　培养基的效价，相对效价：ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｉｔｅｒ）见表６。　表６中心组合设计及其实验结果　Ｔａｂ．６　Ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　２．４响应面分析及响应面方程的建立　运用软件对结果进行分析，建立多杀菌素产量　对３个显著影响因素的多元二次方程，如式（１）所示。　对实验方差分析结果如下表７。　Ｙ＝一５０７８．５７２６１＋２２９．９２８７９ｘＸ１－４－１８．８５４９６×　Ｘ２＋３ｌ　１．５８４７４ｘＸ４＋０．９２３１３ｘＸＩＸ２＋４．５８９５８ｘＸｌＸ４　＋１２．２６２５０　ｘＸ２Ｘ４—３．０５７８９　ｘＸ１　一３．５　１６４８　ｘＸ２２—　１０８．０９３４６ｘＸ４　（１）　由表７可知，该模型极显著（Ｐ＜Ｏ．０００１），相关系　数为Ｒ　＝０．９５１７，说明回归拟合较好，失拟项不显著，　ＤＦ：Ｄｅｇｒｅｅｓ　ｏｆ　ｆｒｅｅｄｏｍ；ＳＳ：Ｓｕｍ　ｏｆ　ｓｑｕａｒｅｓ；　ＭＳ：Ｍｅａｎ　ｓｑｕａｒｅ　说明回归显著，因此说明该模型方程能够较好的用　于多杀菌素培养基组份及其产量的预测。　由图２可得出，ｘ　、Ｘ　和Ｘ　存在极值点，　Ｓｐｉｎｏｓａｄ的最大估计值为相对效价１７０．９７％，对应的　因素浓度为葡萄糖４１．９８ｇ／Ｌ，糊精１３．６ｇ／Ｌ，酵母粉　３．１ｇ／Ｌ。　４０．００　’。。Ａ：　ｏｓ　。　，　Ｉ　ａｄ＇　、　｛　ｌ　ｒ２．．．（７静．：－－ｅ－－ｒ　－，－＋－．ｇ＞ｉ＇　薰５０簟ｓｐｉｎｏｓａｄ　图２响应面分析法得到的曲面图和等高线　Ｆｉｇ．２　３Ｄ　ａｎｄ　ｉｓｏｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｃｏｎｔｏｕｒ　ｐｌｏｔ　ｏｆ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　２．５回归模型实验验证　经过实验设计和结果分析得到优化培养基配方　及发酵条件：葡萄糖４１．９８ｇ／Ｌ，糊精１３．６ｇ／Ｌ，ＰＭＭ　第４７卷（蕙第１６４期）　杨睿智等：响应面法优化多杀菌素发酵条件　『４ｌ　Ｖｉｎｃｅｎｔ　Ｌ　Ｓ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｐｉｎｏｓａｄ　２Ｏｇ／Ｌ，酵母粉３．１ｇ／Ｌ，鱼粉１０ｇ／Ｌ，硫酸铵１．５　Ｌ，硫　酸镁０．１ｇ／Ｌ，碳酸钙３ｇ／Ｌ，接种量１０％，初始ｐＨ　７．０。　为验证实验的可靠性，采用上述最优发酵条件进行　Ｓｐｉｎｏｓａｄ发酵验证实验，３次平行实验的Ｓｐｉｎｏｓａｄ的　产量的相对效价分别为：１６９．３１％，１６６．９８％和　１７３．０５％，Ｓｐｉｎｏｓａｄ的平均产量的相对效价为　ｉｎｓｅｃｔ　ｓｙｍｐｔｏｍｓ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ【Ｊ］．ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙｒ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９８（６０）：９１—１０２　【５】　Ｃｒｏｕｓｅ　Ｇ　Ｄ，ｐａｒｋｓ　Ｔ　Ｃ，Ｓｃｈｏｏｎｏｖｅｒ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ，Ｒｅｃｅｎｔ　ａｄｖａｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｓｐｉｎｏｓｙｎ【ＪＪ．Ｐｅｓｔ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，５７（２）：１７７—１８５　［６】　Ｍｏｒａｎｄｉｎ　ＬＡ，Ｗｉｎｓｔｏｎ　ＭＬ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　ＭＴ，ｅｔ　ａ１．Ｌｅｔｈａｌ　ａｎｄ　ｓｕｂ—ｌｅｔｈａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｓｐｉｎｏｓａｄ　ｏｎ　ｂｕｍｂｌｅ　ｂｅｅｓ（Ｂｏｍｂｕｓ　１６９．７８％，实测平均值与预测值无显著差别，证明此　次响应面实验参数准确可靠，具有使用价值。　３结论　ｉｍｐａｔｉｅｎｓ　Ｃｒｅｓｓｏｎ）［Ｊ］．Ｐｅｓｔ　Ｍａｎａｇ　Ｓｃｉ，２００５，６１（７）：６１９—６２６．　［７】　Ｓｔａｒｋ　ＪＤ，Ｖａｒｇａｓ　ＲＩ．Ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　Ｄａｐｈｎｉａ　本实验首先采用ＰＢ法，以多杀菌素的产量为　ｐｕｌｅｘ　（Ｌｅｙｄｉｇ）ａｆｔｅｒ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ　ｓｐｉｎｏｓａｄ　ａｎｄ　ｄｉａｚｉｎｏｎ［Ｊ］．Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌ　Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｓａｆ，２００３，５６（３）：３３４—　３３８．　响应值，对碳源、氮源、微量元素及发酵条件等１Ｏ个　因素进行全面考察，从中选出了３个影响显著的主　要因子，即葡萄糖、糊精和酵母粉。通过最陡爬坡实　［８】Ｓｔｅｂｂｉｎｓ　ＫＥ，Ｂｏｎｄ　ＤＭ，Ｎｏｖｉｌｌａ　ＭＮ，ｅｔ　ａ１．Ｓｐｉｎｏｓａｄ　ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅ：ｓｕｂｃｈｒｏｎｉｅ　ａｎｄ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｌａｃｋ　ｏｆ　验找出其峰值。最后通过中心组合实验进行优化组　合，得到了最终培养基及发酵条件组成为葡萄糖　４１．９８ｇ／Ｌ，糊精１３．６ｇ／Ｌ，棉籽粉２０　ｇ／Ｌ，酵母粉３．１ｇ／　Ｌ，鱼粉１０　ｇ／Ｌ，硫酸铵１．５ｇ／Ｌ，硫酸镁０．１ｇ／Ｌ，接种量　１０％，碳酸钙３　ｇ／Ｌ，初始ｐＨ　７．０，摇床转速２２０ｒ／　ｍｉｎ，培养７ｄ。在此培养条件下进行多杀菌素的发酵　实验，得到多杀菌素的产量提高了６９．７８％　参考文献：　【１】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｇ，Ｍｉｃｈｅｌ　Ｋ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ　ａｎｄ　ａ　ｎｅｗ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｉｎｓｅｃｔ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ【Ｊ］．Ｄｏｗｎ　ｔｏ　Ｅａｒｔｈ，１９９７，５２（１）：１－５．　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ＣＤ一１　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ｓｃｉ，２００２，６５（２）：　２７６－２８７．　［９】杜顺堂，朱明军，梁世中．生物农药多杀菌素的研究进展【Ｊｊ　．农药，２００５，４４（１０）：４４１—４４５．　［１０】王步江，张陈云，樊秀花．响应面法优化产油酵母发酵培　养基【ＪＪ．中国酿造，２０１０，７：１２７—１２９　［１ｌ】　田英华，刘晓兰，秦松颖等．响应面法优化果胶复合酶固　态发酵工艺研究『Ｊ１．食品科技，２０１０，３５（９）：８－１２　［１２】朴美子，于翠芳，宁杰等．响应面优化法黑木耳糙米醋的　发酵工艺［Ｊ］．食品工业科技，２０１０，３１（７）：１９７－２００　［１３】赵博，赵晓云，李志洲．响应面分析法优化微波辅助提取荷　叶多酚的工艺研究【Ｊ］．食品与发酵科技，２０１０，０２：８５—８８　［１４］叶砚，蒋冬花，嵇豪．响应面法优化红曲霉Ｘ２７液态发酵　【２】Ｍｅｒｔｚ　ＦＰ，Ｙａｏ　ＲＣ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｓｐｉｎｏｓａ　ｓｐ．ｎｏｖ．　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｏｉｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ａ　ｓｕｇａｒ　ｒｕｍ　ｓｔｉｌｌ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　产　一氨基丁酸工艺条件ｆＪ］．中国粮油学报，２０１０，２５（９）：　１０６－１１０　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９０，４０（１）：３４－３９．　【３】　向双云，周珍辉，宋渊，等．新型生物农药——多杀菌素【Ｊ］．　现代生物医学进展，２００８，８（９）：１７５０—１７５２．　・◆・’・　・・・・・　・・・・・・・・・・・　・・・”・・・・・・◆・　【１５】孙庆申，曹相辉，李冰等．响应面法优化面包酵母菌种子　培养基的研究【Ｊ】．食品工业科技，２０１０，３１（９）：１７５－１８１　●；生　　－　活小百科　ｉ！ｉ：　●　中暑后不要吃生冷瓜果大量饮水　很多人认为，中暑就是“人被热坏了”，自然　中暑后人的脾胃虚弱，食用生冷瓜果会损伤　阳气，使脾胃出现痉挛或血流不畅，致使寒湿内　应该在第一时间吃点凉的给身体“降温”。于是，　凉白开水不停地灌，水果也没少吃，却觉得身体　越来越虚。　滞，引起腹痛、腹泻等。另外，中暑后人体内外的　温度相当，食用生冷瓜果会使体内温度骤降，暑　其实，中暑后大量饮水，不仅会增加心脏的　热积聚在身体的某个部位而无法散发出来，不利　于缓解症状。如想尽快恢复体力，可吃些易　负担，还会冲淡胃液，影响消化功能，使中暑者加　重恶心、呕吐的症状。因此，中暑后喝水以适量为　宜　的菜类和粥、面，或在医生指导下，服用藿香　水等解暑药物。