引物设计方法

引物设计

正向引物：（1）首先从目的蛋白的基因序列的开头选取近十五个左右的基因，然后放入Tm Calculator（http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/）中检测Tm值，是否在65℃左右。如果过低，则将取的基因数目增加，一直到Tm满足要求；如果过高，则减少所取的基因数目，满足Tm要求（bp不能小于15bp，一般为15-30bp）。另外，5’端不能改变，3’端必须以C或G结尾。

（2）在质粒载体上找到最佳的酶切位点，不要切掉质粒载体中的有用部分或者标签（质粒载体有分N-端与C-端），选择好酶切位点。

（3）使用ApE（软件，可下载），将目的蛋白的基因全部黏贴进去，检查其中所有的酶切位点（Enzyme——> Enzyme selector）。如果我们选择的酶切位点在目的基因中存在，则此酶切位点不能使用（会导致基因产物无法获得）；若选择的酶切位点不存在与目的基因中，则可以使用。

（4）质粒载体中选取的酶切位点，将其基因序列放到NEBcutter（http://tools.neb.com/NEBcutter2/）中进行更加精确的酶切位点显示（如：

），再次确定。

（5）最后确定连接到引物上的酶切位点序列需要充分考虑ORF的要求（即三个基因确定一个蛋白质，错位的话会导致目的产物错误），从ATG开始，不能发生错位。（例如：

CTT GCG GCC GCG AAT TCA中）TCA为一组，而酶切位点到TC结束，必须将A加上。然后从酶切位点开始，如上图即从AATTC中的T开始往左数16bp的基因（至少15bp，15-18bp）。然后将其连接到（1）中满足Tm的基因的5’端。（如：CTT GCG GCC GCG AAT TCA atggcg gatgaagcca c）

附：如果引物中酶切位点最后为ATG 而与其相连的目的蛋白的基因开始也是ATG 则可以删除一组，留一组即可。例：Nde1 Ufm 1 FOR

CGCGCGGCAGCCATATG（atg） tcgaaggtttcctttaagatcac

反向引物：步骤与正向引物相似，不过（1）从目的蛋白的基因的3’-端开始往前取，取到满足Tm值的。其次，此时3’端不能变，而5’端必须以C或G结尾。（2）（3）（4）步骤都一样，（5）可以不用考虑ORF的问题，因为其在酶切位点就不会再往下pcr了。设计好后，使用ApE中的Reverse Complement，使其反转，完成引物设计。