乳与乳制品检验方法汇编

乳与乳制品检验方法汇编(第三版)

汇编：蒋懿超

前 言

本汇编内的原奶及奶粉掺假检验方法等同采用伊利集团内部检验方法,理化检验方法等效采用IDF相关标准、GB／T５４１3-１997,GB／Ｔ５０0９-２003,个别地方根据实验具体情况做了适当修改；微生物检验方法等同采用GB/T4789－２0０3，部分检验项目等效采用IDF标准。

目 录

前言——————————————————————————————---1 目录——————————————————————————————－--2 第一部分 原料奶新鲜度和掺杂异物的检验方法

YLNB １.1 酒精实验——————————————————————－－5

YLＮB 1.2 美兰实验——————————————————————--６

YLNB １.3 碱性物质的检出———————————————————--８

YLNB １.４ 食盐的检出—————————————————————--10

YLNB １.5 硝酸盐,亚硝酸盐的检出———————————————-－１2

YLNＢ1.6 糊精的检出—————————————————————--14

ＹLＮB 1．7 淀粉的检出————————————————————－－--15

ＹＬNB １.8 硫酸盐的检出————————————————————－-16

YLNB １.9 蔗糖的检出—————————————————————--１7

YLＮＢ １.１０ 尿素的检出—————————————————————--18

YLNB 1．11 饴糖(糖稀）及葡萄糖的检出—————————————--19 ＹLNB 1.1２ 甲醛的检出—————————————————————-

－２0

YLNB１.13 硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠的检出————————————--21

ＹＬＮB1.14 过氧化氢的检出 ——————————————————－--23

YＬNB1.15 乳中掺入水解蛋白的检测出———————————————２５

YLNB １.16 乳中不溶性物质的检出—————————————————27

第二部分 乳与乳制品常规理化指标检验方法

ＹLＮB 2.１ 滴定酸度的检测————————————————————２8

YＬNＢ ２.2 灰分的检测—————————————————————--34

YLNB ２.3 全脂乳固体的检测——————————————————－－36

ＹＬNB 2.4 总固形物的检测———————————————————--38

YLＮB 2.5 水分的检测—————————————————————--4２

YLNB 2.6 脂肪的检测—————————————————————--４4

YLNB ２．７ 乳糖和蔗糖的检测——————————————————--53

YLＮＢ ２.8 蛋白质的检测—————————————————————6２

YLNB 2．9 不溶度指数的检测——————————————————--６８

YＬNＢ 2.１0 乳与乳粉中杂质度的检测———————————————

—73

YLＮB ２.１１ 硝酸盐，亚硝酸盐的检测————————————————７4

ＹLNB 2.12 乳铁蛋白饱和度的检测—————————————————82

第三部分 乳与乳制品微生物检验方法

YＬNB 3.1 菌落总数检测————————————————————--84

YLNB 3．2 大肠菌群检测————————————————————－-9０

YＬNB 3.3 嗜冷菌检测—————————————————————--96

ＹLNB ３.4 霉菌和酵母菌的计数—————————————————－- 1００

YLＮB 3.5 鲜乳中抗生素残留检测—————————————————1０3

ＹLＮＢ 3.6 芽孢和耐热芽孢检测—————————————————--1０6

YLＮB 3.７ 双歧杆菌检测—————————————————————109

YLNB 3.8 染色技术——————————————————————－-１1２

ＹLNB 3.9 显微技术———————————————————————１１6

第四部分 乳与乳制品病原微生物检验方法

YLＮＢ４.1 金黄色葡萄球菌的检测——————————————————119

YＬNB4.２ 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测——————————————--12３

YLNB4.3 沙门氏菌的检测—————————————————————１26

YＬNB４．4 志贺氏菌的检测—————————————————————１３２

ＹＬNB４．5 溶血性链球菌的检测————――—————————————136

YLNB4．6 单增李斯特菌的检测—————————————————----139

YLNB4.7 阪崎肠杆菌的检测———————————————————－-14６

YＬＮB4．8 粪链球菌群的检测———————————————————--15２

附图1 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片 附图２ 金黄色葡萄球菌的平板菌落照片 附图3 金黄色葡萄球菌在BＰ平板上的菌落形态 附图4 志贺氏菌落在SS平板上的照片 附图5 大肠杆菌革兰氏染色照片 第五部分 乳与乳制品非常规指标分析方法

YＬＮＢ 5.1 乳与乳制品中黄曲霉毒素Ｍ1的检测———————————1６

3

ＹLNＢ 5.2 食品及饲料中黄曲霉毒素B1的检测————————————１

6

５

YLNB 5.3 预混料中维生素C的含量的检测(常规法）——————————１6７

YLNB ５.４ 维生素Ｃ的检测————————————---－-－-－------－－－-169

YLＮB ５.5 奶酪中脂肪含量以及食盐含量的检测————————————172

YＬNB ５.6 磷的检测 ————————————－-----－－----------

－---17７

YLNB 5.7 DＨA、AA的检测————————————----－------－-－-----18０

ＹＬNB 5.８ 维生素B１的检测———————————-－---－--－-------－-－-184

YLNB 5.9 碘的检测-－--－------－－－----－-－----------－-－-------－------１87

ＹＬNB ５.10 维生素A、E的检测——————————----－---------------1９1

YLNB 5.１1 山梨酸、苯甲酸、糖精钠的检测————————————----１95

ＹLNＢ 5.12 维生素Ｂ6的检测———————————---－--－-------－-－－-－198

YLNB 5.13 烟酸和烟酸铵的检测---－----－－-----－-－--－--------－-－－-－－－-２01

YLＮＢ 5.14 乳制品中钾、钠、钙、镁、铁、锌、铜和锰的检测-－-－------－---204

ＹLNB 5.15 乳制品中铅的检测--－-------－-－-----------－－----－－----－--－2０9

YＬNB 5.16 乳制品中总砷的检测--－--－－--－----------－-----------------2１2

ＹLNＢ 5．１7 乳制品中硒的检测----－----－---－－-－---------－－-－

－-－------－215

原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

酒精实验 ＹＬNＢ 1.1 １. 原理

生鲜牛乳在酸度升高后，与等体积中性酒精混合后会出现絮片, 通过絮片的产生情况判定是否可通过该浓度的酒精。 2. 试剂

所有试剂均应为分析纯；实验用水至少应是蒸馏水。

酒精:根据需要用分析纯中性乙醇配制72%（v/v）, 75％(v/v），７8%(v/ｖ）的酒精（必要时配制74%(v/v）的酒精)。

注:如酒精呈酸性，使用前可用０.1mｏｌ/l或1 ｍｏl／l NａOH进行中和，中和时推荐使用５g/l酚酞指示剂。 3. 器材

3.1 平皿:直径8０-90 mm

3．２ 温度计:检定合格的玻璃温度计或探测式温度计 ３.3 酒精计:检定合格的酒精计 3.4 量筒：２5 ml 3.5 吸管:２ ｍｌ。 4. 方法

4．1 准确吸取2 ｍl牛奶于平皿中。

注：a.该步骤开始后,应将试验连续进行下去直至完成,中间不得间断； b.酒精加入混合均匀后,应在３０秒内观察结果。

4.2 根据需要在加有奶样的平皿中加入２ ml酒精,要边加边摇,使酒精与牛奶均匀混合，观察是否有絮片生成（絮片无论大小)。

注:试验应在20ºC的温度下进行，必要时扩大取样量和检样量。

5. 结果判定

出现絮片的牛乳为该浓度下的酒精试验阳性乳。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

YLＮＢ 1．2 １．原理

美兰还原试验是用来判断原料乳新鲜程度的一种色素还原试验。新鲜乳加入亚甲基兰后染为蓝色。如污染大量微生物产生还原酶使颜色逐渐变浅，直至无色,通过测定颜色变化时间，间接推断出鲜奶的卫生质量。 ２.试剂

亚甲蓝水溶液：0.01g/300ml ３．器材

3.1 试管,20mm×2０0ｍm 3．2 水浴锅:可恒温到3８℃ 4.方法

4.1 吸取10ml牛奶于灭菌试管中,在水浴中加热到３８℃,再加入亚甲基兰溶液1ml，混匀。

４.2 将试管放入水浴中,每30mｉn观察一次褪色情况,并记录每个样品褪色时间。 5.结果判定

通常，通过溶液的褪色时间可以估算出牛奶中细菌总数。(应为开始退色的时间计)。 6.影响因素

6.1细菌的活性：由于原奶在实验前冷藏时间的延长,传统的适温菌型（产酸菌的牛奶菌丝),逐渐转换为嗜冷菌型（分解蛋白质和脂肪的菌丝），脱色时间和细菌总数之间的相关性变弱。

美兰实验

６.2溶液的退色时间与染色液的浓度有关。

6.3此方法对体细胞（白细胞）及其他细胞的还原作用也敏感，因此还可检验异常乳（乳房炎及初乳或末乳）。 裉色时间相当每mｌ牛乳中的细菌总数

20ｍinﻩ >2×１07

２0－40min １.0×107－2．0×107 4０ｍin-1小时ﻩ 5．0×106-1.0×１07 １小时-2小时ﻩ ４.0×10６-5.0×1０６ 2小时-３小时 3.0×1０-４．0×10 3小时-4小时ﻩ 2.0×10－3.0×10 ４小时-5小时 1.０×１0-2.0×1０ 5小时-5.５小时 ５.0×10-１．0×10 5．5小时-6.5小时 3.0×10-5.0×１0 6.5小时-７．5小时 １.0×１0－3．0×１０ >７.５小时 〈1.0×10

注：此方法较适用于原料奶的验收检验，所以一般时间控制在40分钟之内观察为

宜。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

碱性物质的检出 YLNB 1.3 方法一:玫瑰红酸法（仲裁法） 1.原理

鲜奶中如掺碱,可使指示剂变色,根据颜色的不同,粗略判断加碱量的多少。 2.试剂

玫瑰红酸(0.05%乙醇溶液)：称取0.０5ｇ玫瑰红酸溶于1０0mｌ 95%的乙醇中。 ３．方法

于盛有2ｍl牛乳的试管中加入2ml玫瑰红酸溶液，摇匀,观察颜色变化。 ４.结果判定

正常色：如图（1)(２)(3)（4）;

（1） （2） （3） (4)

异常色：如下图

(a量) (ｂ量)

(c量) 注明：(１）牛奶酸度及新鲜度影响最终颜色的判定，酸度越高、新鲜度越差最终颜色越黄 。 （2)最低检测限:弱碱为０.０2％

强碱为０.0０6%

方法二：溴麝香草酚兰法

1.１原理

鲜乳中如掺碱物质，可使指示剂变色，由颜色的不同,大略判断加碱量的多少。 1.２器材

试管：Ｆ 18×180ｍm 试管架 吸管：2mｌ 1.3试剂

取０.０4克溴百里香草酚兰（溴麝香草酚兰）溶于1００ｍｌ９5%分析纯乙醇中。 1.4方法

取乳样约2ml于小试管中,沿管壁慢慢加入指示剂约０.5ｍl,将试管轻轻斜转２-3圈,然后垂直放置2分钟后,观察指示剂与样品接触面颜色特征以判定检验结果。同时用不含碱的正常生鲜牛乳作空白对照。 1.5结果判定 正常奶:黄色

掺碱奶：0.03%黄绿色 0.０5%淡绿色 0．１%绿色 0.3％深绿色 0.5%青绿色 0．7%淡青色 1．０%青色 1.5％深青色 1.6注意事项

掺水乳(因水的PＨ大都在7—9之间）、掺洗衣粉乳(因洗衣粉中加有碳酸钠)、乳房炎乳(因为细菌分解乳酪蛋白产生氨及乳房代谢功能的改变而造成PH值升高)与掺碱指示剂的接触面均可呈黄绿至淡绿色。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

食盐的检出 YLNB

1.4

1. 原理

鲜奶中氯化物与硝酸银反应,生成氯化银沉淀，用铬酸钾指示剂，当牛奶中的氯化物与硝酸银作用后,过量的硝酸银与铬酸钾生成砖红色的Ag2CrO4 沉淀。 2. 试剂

2.1 9．６g/Ｌ硝酸银溶液：取分析纯硝酸银置于1０5℃烘箱内烘30mｉn，取出放在干燥器内冷却后，称取9.６g溶于1000ml蒸馏水中。

2.2 1０0g/l铬酸钾溶液：称取分析纯铬酸钾1０g溶于10０ｍｌ蒸馏水中。 注:硝酸银溶液应储存于棕色试剂瓶备用。 ３． 器材 3.1 吸管：2 ml 3.2 试管: 18 ×180 mｍ ４. 方法

取2ml牛乳于试管中,加入100g/l铬酸钾溶液5滴,摇匀，再加入9.6g/L硝酸银溶液1.5ml，摇匀后,立即观察结果。

注:在加入硝酸银后，应立即观察颜色,做出判定;否则,判定结果会偏高。 ５. 结果判定

正常色：

掺盐乳：呈黄色,且随着掺入量的增多,颜色由土黄色向鲜黄色变化

( (a量盐）

（b量盐)

(c量盐） 最低检测限为0.05％ 6. 注意事项

６.1试剂加入顺序不同影响测定结果,先加入硝酸银其结果偏高１0—20％,因此应按“牛奶+指示剂+硝酸银”或“指示剂+牛奶+硝酸银”的顺序进行。 6．2 日常试验应尽量在2０ºC左右的室温下进行，仲裁试验必须在20ºC条件下进行。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

YＬNB 1.5

方法一：固体试剂法 1. 原理

鲜奶中的亚硝酸盐与显色试剂作用,形成红色的化合物；鲜奶中的硝酸盐被还原成亚硝酸盐后，再与显色试剂形成红色化合物。 2. 试剂

哈尔滨龙泽科技有限公司的鲜奶亚硝酸盐和硝酸盐试剂。（使用之前要对该试剂验证,确保药品的有效性) 3. 方法

取鲜奶亚硝酸盐或硝酸盐试剂（按试剂说明添加）到试管中，加入被检奶样，振荡混合均匀,必要时加热溶解，5-１0分钟内观察结果。 4. 结果判定: 正常乳:呈无色

掺亚硝酸盐或硝酸盐乳:呈粉红色，且由掺入量的增加，颜色逐渐加深。

（a量）

（b量)

亚硝酸盐和硝酸盐检出

最低检测限：硝酸盐为２*10-6

亚硝酸盐为:１０－８

5. 注意事项

5．1.1 药品瓶必须用颜色较深的纸包好避光保存。 5.1．2 药品置于干燥的环境中保存,最好放在干燥器中。

5.1.3 已打开包装的药品要密封好后于干燥器中避光保存，如果发现有结块现象应立即停止使用。

5．1.4 硝酸盐检测时，所加硝盐试剂要足量(约0.３克）,要使试剂和样品充分混匀后，应在5分钟内观察结果。 方法二：液体试剂法(仲裁法) 1.试剂

１.1显色剂：称取对－氨基苯磺酸0.６g,甲－萘胺０．２g,甲－萘酚0.１g,溶于４０0ml ５0%的醋酸溶液中，置棕色试剂瓶中保存。

1.２还原剂：硫酸钡４4.0g, 硫酸锰5.0g, 锌粉1.0g, 混合在一起,干燥研磨成细粉末，密闭保存。

2.方法：吸取2.0ml牛乳于试管中，加入还原剂约０.1g混匀（亚硝酸盐检测不加还原剂)，加显色剂0.5-1．0 (ｍl)摇匀, ５-1０分钟内观察结果。 3. 结果判定：

掺假乳:微粉－水粉－粉红－红色

(根据颜色的深浅判断硝酸盐和亚硝酸盐含量的大小） 正常乳:无色

4． 注意事项：还原剂配制时，一定要研磨均匀,否则会严重影响硝酸盐检测。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

糊精类物质的检出 YLNB

1．6

１．试剂： B试剂,C试剂（由内蒙古农业大学提供） 2．方法

２．1取一定体积的被检奶样置于高速的离心机上离心（转速为40００r/min)2０分钟,去除浮在上面的脂肪；

２.2在剩余的乳样中加入冰醋酸(每５0ml加2．3-２.５ml)摇匀,再次离心(同上),弃去沉淀,收集乳清;

2．3在收集的乳清中加入Ｂ试剂（每５ml乳清加0．６mlB试剂),继续离心，弃去沉淀，收集上清液，将其作为待测检样； 2.4取1ml乳清于小试管中加C试剂3ml,摇匀。 3．结果判定

正常乳：没有沉淀产生或摇匀后为澄清透明的液体。 掺糊精乳:混浊的液体。 最低检出限为0．０5% 。 ４.注意事项

１、脂肪必须去除干净,特别是油滴层。 ２、吸取上清液时不要触及底部的沉淀物。

3、得到乳清液必须澄清,否则需要相应增加Ｂ试剂的使用量,至达到澄清为止。 4、加入C试剂混合均匀后２分钟内。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法 淀粉的检出 YＬNＢ 1.7

1. 原理:淀粉遇碘呈兰色反应。 2． 试剂

KI—I试剂：碘化钾20g加碘5g先用大约20mｌ的蒸馏水溶解,然后定容至250mｌ。 3. 方法

取乳2mｌ，加热煮沸,观察乳液是否有沉积现象,冷却后加入3－5滴KI—Ｉ试剂。 ４. 判定结果 正常奶：呈黄色；

掺淀粉奶:呈蓝色或青蓝色沉淀物出现。 正常色:

掺淀粉奶:呈兰色，且颜色深浅与掺入量成正比。

a量：

b量:

ｃ量:

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

硫酸盐的检出 YLＮB １.8 １. 原理

鲜奶中的硫酸盐与氯化钡形成硫酸钡沉淀,过量的钡离子与玫红酸钠反应生成玫红酸钡呈玫瑰红色。若鲜奶中掺入硫酸盐后,因氯化钡被硫酸盐全部沉淀，无游离的钡离子，因而不能与玫红酸反应,故呈黄色。 2. 试剂

2．1 称取氯化钡3克，加蒸馏水少许溶解后，加浓盐酸20ml,加蒸馏水至250ｍｌ。

2.２ 玫红酸钠１克，氯化钠49克，干燥研磨至粉末状,密闭保存。 3. 方法

取乳2ml于小试管中,加入玫红酸钠指示剂约0.3克混匀，加氯化钡溶液４—5滴混匀，放置３—5分钟后观察结果。 4.结果判定 正常乳:呈玫瑰红色;

掺入硫酸盐乳呈黄色或土黄色。 最低检出量:0.１%。 5.注意事项

5.1 严格控制酸度，酸度过大易褪色,酸度不足不显色。

5．２ 对不能判定奶样可取奶１0ml，加10%氯化钡溶液0.5—1ｍl离心沉淀，正常鲜奶沉淀物很少,掺硫酸盐奶有较多量硫酸钡沉淀。 5.３玫红酸钠与氯化钠混合后，研磨至粉末状，防止吸潮。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

蔗糖的检出 YLNB 1.９ 1． 原理

蔗糖在酸性溶液中水解产生的果糖与溶于强酸内的间苯二酚溶液加热后显红色沉淀反应。 2． 试剂

称取间苯二酚0．４克用少量蒸馏水溶解，加浓盐酸200ml,再加蒸馏水稀释至600ml置棕色瓶，现用现配。 3. 方法

取间苯二酚盐酸溶液１．5mｌ于小试管中,加鲜乳５滴,水浴加热煮沸2.5分钟，观察结果。 4. 结果判定 图A

掺蔗糖乳:

ａ

图B

量

:如图B

正常色：如

图

A

b

图C

c

图D

5.注意事项

５．1 盐酸浓度不能高也不能低否则影响显色反应。

5.2 试剂须置棕色瓶中，配制及贮存过程中被有机物污染,颜色变黄或变红则不能

使用。

5.3 加热时间过长,其它醛类糖也能产生浅红色的反应。

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量

：如图量

:如图C

D

原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

尿素的检出 YＬNＢ

1.１0

1.原理

尿素与二乙酰——肟在酸性条件下,经镉离子（或三价铁离子）的催化产生缩合，并在氨基硫脲存在下,生成３，5，6—三甲基—１,２，４三胺的红色复合物。 2.试剂

2.1 酸性试剂：在1升容量瓶中加入蒸馏水约100mｌ,然后加入浓硫酸4４ｍl及85%磷酸6６ml，冷却至室温后，加入硫氨脲３０ｍg，硫酸镉２克溶解后用蒸馏水稀释至１０00ml。贮棕色瓶中冰箱内保存半年不变。

2.2 2％二乙酰——肟试剂:称取二乙酰一一肟2克,溶于100ml蒸馏水中。贮棕色瓶中放置冰箱内，可保存半年不变。

2.3 应用液：取酸性试剂９0ｍl加2%二乙酰一一肟10ml混合均匀,即可使用。 ３. 方法

取应用液1ｍl于试管中,加鲜奶一滴加热煮沸约1分钟后观察结果。 4．结果判定 正常:无色或微红色；

掺入尿素或尿的奶立即呈深红色。掺入量越大,显色越快,红色越深； 最低检出限为0. ０3 % 。

注：正常奶煮沸时间超过2分钟,也可出现淡红色。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

饴糖(糖稀）及葡萄糖的检出 ＹLNB

1.11

１． 原理

饴糖中的葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化生成葡萄糖酸及过氧化氢;后者在过氧化物酶的作用下,使还原性氧受体邻联甲苯铵氧化成兰色化合物。 2．方法

用医院用来检验尿糖用的尿糖试纸测试。 3．结果判定

按照尿糖试纸上的要求进行判定。大于０含量即判定为阳性。 最低检测限为0．05% 。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

甲醛的检出 YLNB １.12 １． 原理

甲醛常被作为防腐剂而掺入牛乳中，鲜奶中的甲醛在酸性溶液中与三氯化铁产生紫色反应。 2. 试剂

称取0.2ｇ三氯化铁溶于100ml浓盐酸中。 3. 器材

3.１ 吸管:2ml，0．5 mｌ 3.２ 试管： １８ ×１80 mm 3．3 试管架 3．４可调式电炉 4. 方法

取乳样２ｍl于小试管中,加入三氯化铁盐酸溶液0.5mｌ，混匀于沸水中水浴1分钟，观察颜色。 ５. 结果判定

正常：呈黄色或淡黄褐色。 掺甲醛乳：呈紫色。

最低检出量１/4000。有些涂料中含有甲醛或甲醛的衍生物，亦可检出。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠的检出 YLN

Ｂ 1.１3 １.原理

硫代硫酸钠(Nａ2S2O3)、焦亚硫酸钠（Nａ2S2O５）都具有强烈的还原性和漂白作用,它们能把碘(I2)还原成碘离子（I-)，从而使碘失去了遇淀粉变蓝的能力。 ２.试剂

1)碘-碘化钾溶液:7g碘与１8ｇ碘化钾溶于10０mｌ水中,稀释至1000ml。 贮存于棕色试剂瓶中,避光保存。 2) 10ｇ/L淀粉指示剂，现用现配。 3.方法

取2ml牛奶，加入2滴淀粉指示剂,摇匀后，加入0.05mｌ碘一碘化钾溶液,立即摇匀后观察颜色。

４． 结果判定

正常乳:蓝色(下图的颜色均为正常色)

掺假乳:乳白色或灰白色(如下图)

最低检测限:硫代硫酸钠为０.０２ ％。 焦代硫酸钠为0.01 %。 附加说明

正常色(蓝色)不可能把所有的蓝颜色都逐一的列出来,只要是蓝色系列均为正常色。 注意事项

1、样品和试剂的加入量要求准确加入，并且在加入碘-碘化钾溶液时必须让溶液完全与样品混合，不能挂在管壁上。 ２、淀粉指示剂必须澄清、有效。 ３、摇匀后立即观察。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

方法一:半定量试纸条法: 1. 原理

过氧化氢酶将过氧化氢的氧转移至有机的氧化还原指示剂，形成一种蓝色的氧化产物。 2. 器材 半定量试纸条 3. 方法

3.1取下一试纸条后,立即密封保存管。

3.2将试纸条浸入待测溶液一秒种,将反应区充分浸润。

过氧化氢的检出 YLＮB 1.14

３.3轻轻移开试纸条，抖落过量的水分，１５秒后将反应区的颜色与标准比色条对比。 ４. 结果判定

通过与标准色对比，确定牛乳中的过氧化氢含量，如发现检测中的试纸的蓝色过深,是由于过氧化氢的含量过高而导致。 5． 注意事项

未开启包装的试纸条应在冰箱中保存，开封后应尽可能干燥低温保存。尽量保存在10—２５℃下。

方法二:碘化钾-淀粉方法 1．原理

过氧化氢在酸性条件下，能使碘化物氧化析出碘，KI—I与淀粉反应呈蓝色。 ２.试剂

a.淀粉溶液：溶解３g可溶性淀粉于10mｌ水中,然后将其慢慢倒入1０0ml沸水中，边加边搅拌,溶解完全后,使溶液冷却。现用现配。

b.碘化钾淀粉溶液：将3ｇ碘化钾溶解于5ml水中,将其倒入淀粉溶液中,搅拌均匀。现用现配。

ｃ硫酸溶液, 浓硫酸:水=1:１ ３. 方法

吸取１ｍl鲜奶于试管中，加入0.２ml碘化钾淀粉溶液,混匀。加入硫酸溶液1滴,摇匀，１分钟内观察颜色变化。 4. 结果判定

正常乳：呈乳白色，参考下图

掺防腐剂乳：呈蓝色，且随着掺入量的增加颜色逐渐加深。参考下图

H２O２含量‰ 1．0 0.9 349U 色卡编号 3５0U Ｈ2O2含量‰ 0.09 0．08 25９Ｕ 色卡编号 27５8U 0.8 ０.7 357Ｕ 341U ０.07 0.06 2６85U 289Ｕ ０.6 ３288U 33０2U 0.05 27２U 2７1U 0.5 3035U 303Ｕ ∷ 2８２U ∷ ２768U 0．04 263U 0．4 0.3 0.2 0.1

0．03 0.02 0.０1 0.00 无 无 无 回首页

原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

水解蛋白的检出 YＬNＢ 1.１5 1. 器材

1.１ 量筒１0 mL、100 mL、250 ｍL 1．2 具塞刻度比色管1０ mL 1．３ 小烧杯５0 mL 1.4 移液管1 mL、5 mL 1.5 滤纸ø11 cｍ 1.6 比色管架

1.7 容量瓶(棕色)２5０ mＬ、100 mＬ １.8 玻璃棒

1．9 小牛角勺 1.10 吸水纸 2． 试剂

2.1 打底标样（简称“底标”）配制:含3 ‰ 水解蛋白粉奶样配制方法，用精密天平(万分之一感量）,用５0 ｍＬ洁净干燥小烧杯称取水解蛋白粉0.750 g，然后用自产新鲜未掺假牛奶少量多次（每次30－４0 mＬ鲜奶)溶解,并无损转移至２5０mL容量瓶中，最后用同种鲜奶定容至2５0 ｍＬ刻度，盖上瓶塞,反复颠倒振摇50次以上,以保证充分溶解并混匀。

2.2 5%汞（Ⅱ）盐溶液:用洁净小烧杯在天平上称取硝酸汞（AR级)试剂1２.5 g,小心地用１0 mＬ量筒量取4 ｍL浓硝酸倒入小烧杯中,进而加蒸馏水溶解并无损转移至250 mＬ棕色容量瓶中（用少许蒸馏水冲洗小烧杯３－４次均转移至容量瓶中）,最后用蒸馏水定容至２５０ mＬ,摇匀。

２．3 饱和苦味酸溶液：用小牛角勺取苦味酸两小勺，小心地置入100 mL棕色容量瓶中,用洗瓶冲洗试剂至瓶下部，再加入蒸馏水至刻度,反复振摇50次，并放置过夜使之达到溶解平衡即为饱和溶液(注意观察容量瓶底部始终应有固体试剂残留才为饱和状态)。 3.方法

取1０ ｍL具塞比色管若干支，编号后置于比色管架上,用1 ｍL移液管吸取1．00 mＬ“底标”奶液注入每支比色管中，再用5ml移液管吸取待测奶样4.0０ mＬ注入加标比色管中,注意记录样号与管号对应关系,然后盖塞充分振荡混匀样品。用另一支5 mL移液管吸取５ %硝酸汞溶液5．00 mL依次加入各样品管中,盖塞摇匀,等待5分钟(在此期间，准备好与比色管相同个数的５０ mL洁净小烧杯，折好滤纸置各烧杯上）后,将各比色管中奶样倒入滤纸中进行无漏斗过滤操作，约2分钟后，各烧杯中滤液即达5 mＬ以上，此时弃去滤纸及其内容物，用另一５ mL移液管分别移取滤液各2.００ mL分别注入另一组（即比色管架上已备好的另一排1０mＬ比色管）中，再用一支5 mL移液管吸取2．００ mL饱和苦味酸溶液分别加入各个盛滤液比色管中,盖塞摇匀，然后在白色或黑白相间或透明空间背景下观察混浊情况,若有淡黄色浑浊出现即为阳性。操作时以未掺假鲜奶做对照,即移取该奶样4．0０ mL注入编为“０”号的比色管中，加入5 mＬ汞盐

试液,以下操作同于样品检测。 4. 检测原理及有关说明

４．1 加入汞盐即可使乳中蛋白质变性凝聚,通过过滤操作即可除去，但水解蛋白与汞盐不发生沉淀反应,通过该步骤即可实现乳中固有蛋白与人为加入的蛋白质成分分离。

4.2 因苦味酸具有比汞盐更强的沉淀作用，其与水解蛋白中的碱性基团(氨基)作用即可形成难溶的有机盐类沉淀，故使体系出现浑浊,当水解蛋白粉在奶样中含量高于1 %时,此操作步骤则会较快出现浅黄色沉淀析出的现象。

4．3 任何难溶物均具有与温度密切相关的溶度积常数，水解蛋白粉与苦味酸的作用也不例外,操作中给待检样中加入“底标奶样”是为了提高检测方法的灵敏度，即通过该措施可以达到含量万分之五水解蛋白粉的奶样稳定检出阳性结果的目的。

4．4苦味酸性状:苦味酸化学名称为2,4,６-三硝基苯酚，为黄色晶体或粉末，苦味有毒，密度1．７６3,熔点122℃，不易吸湿,难溶于冷水，较易溶于热水、乙醇、氯仿、苯和乙醚。具有强烈爆炸性,是军事上最早使用的一种烈性炸药。易与多种金属作用生成更易爆炸且危险的苦味酸盐，能与有机碱生成难溶晶体盐类。本身是一种酸性染料,在工业上也用于制造其它染料和照像药品，在医疗上则做为外科收敛剂。

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原料奶新鲜度和掺杂异物检验方法

乳中不溶性物质的检出 YLＮB

1.1６

１. 原理

牛乳中如果掺杂了石膏,滑石粉等不溶于牛乳的物质，在一定速度和时间内用离心机进行离心后,由于其比重较大，会沉淀于离心管的底部，通过观察沉淀的多少，来判断是否为正常牛乳。 2. 仪器及器材

2．１ 离心机：有速度显示器,有适合于离心管（3．2)并可向外转动的套管，转速可达到１０00ｒ／min

2.2 离心管:锥形，标有刻度，最大容量5０ ｍl ,最小刻度0．１ml 3. 方法

３．1 将采好的牛乳样品搅拌均匀，并将温度调为２０℃，将牛乳倒入离心管至

３０ml刻度处。

3.2 将离心管放入离心机中(要对称放置）,使离心管迅速旋转,以1000ｒ/min

的转速旋转５min。

3.3 取出离心管,倒出上清液,加15ml 20℃蒸馏水，用搅拌棒充分搅拌后,倒入

蒸馏水至30ｍｌ刻度处。

３.4 将离心管放入离心机中,以1000r/mｉn的转速旋转３miｎ。

注:将离心管放入离心机中，使离心管的刻度线在离心机旋转时既不朝上也

不朝下,而是处于中间位置。这样即使沉淀物顶部倾斜，沉淀物也很容易估算。

3.5 取出离心管，竖直握住离心管，以适当背景为对照,使眼睛与沉淀物顶部平齐,

读取沉淀物体积数。如果沉淀物顶部倾斜,则估算其体积数（可以读取倾斜面的1/2处刻度）。 4. 结果判定

正常乳：沉淀物体积≤0．1ｍl

掺杂乳：沉淀物体积>0．1ml

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乳与乳制品常规理化指标检验

滴定酸度的检测 ＹLNB

2.1

一、基准法（仲裁法） １. 原理

将一定量的乳粉溶于水中，制成复原乳,或者吸取一定量的牛乳,用０.1ｍoｌ/L氢氧化钠滴定至ｐH为8．3０，由此消耗的0.１mｏl/l氢氧化钠溶液的毫升数可计算出滴定1０0ml牛乳或干物质为１2％的复原乳所需的氢氧化钠量。所需氢氧化钠溶液的量随产品中的自然缓冲物质变酸或添加酸性或碱性物质的量而变化。 ２． 试剂

所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

2.1 氢氧化钠标准溶液:c（OＨ-)为0.1moｌ/ｌ。保护此溶液，防止二氧化碳渗透。

２．１.１ 氢氧化钠标准溶液的配制

将1００g氢氧化钠固体溶解到100ｍl无二氧化碳水中,制成饱和溶液,静置,吸取上清液5．4ml于1000ml容量瓶中，用无二氧化碳水定容。

２．1．2 氢氧化钠标准溶液的标定执行GB/T６01-2002中的方法或下面的方法 称取约０.18g于105—110℃烘至恒重的邻苯二甲酸氢钾，准确至０.1mg,用5０ml无二氧化碳水溶于250mｌ三角瓶中,加两滴5ｇ/l的酚酞指示剂，用配好的氢氧化钠溶液地滴定至粉红色,同时做空白实验。氢氧化钠标准溶液的浓度为:

m

c(NaOＨ)= ——————————

（V-V０）*０.2０４2

式中:c（NａOH)——氢氧化钠的浓度,ｍｏl/l

ｍ ——称取的邻苯二甲酸氢钾的质量,g V ——氢氧化钠的用量，ml

V0 ——空白实验氢氧化钠溶液的用量，ml

2.2 酚酞溶液:取0.5g酚酞溶于75mｌ体积分数为9５％的乙醇中,并加入20ｍl

水，然后再加入氢氧化钠溶液(２.1)，直至加入一滴立即变成粉红色,再加入水定容至100ｍl。

2．３ 氮气 3． 仪器及器材

3.1 天平:灵敏度为0．０１ｇ或更高。

3.2 电位滴定仪或pH计:带电极,（使用之前需进行校正） 3.3 量筒：1０0ｍl

3.4 三角瓶：250ml，带磨口和玻璃塞，颈部可容纳电极,一个滴定管头和一根氮气管。 4． 方法 4.１样品处理

4.1.1 原料奶和液态奶样品:吸取１0ml原料奶或液态奶样品于三角瓶中，加入20ml无二氧化碳蒸馏水,同时做空白。

４.1.２ 酸奶类样品:准确称取5g左右样品于三角瓶中，加入40ｍl40℃无二氧化碳蒸馏水，溶解,同时做空白

4.１．3 奶粉:称取4g样品于三角瓶中，准确至10ｍg。用量筒量取96ml 20℃的无二氧化碳水,使样品复原,剧烈搅拌，然后静置20min，同时做空白。 4.2 用pＨ７和pH9的缓冲溶液校准电位滴定仪,将滴定终点设定为8.３0。 4.3 将盛有样品溶液的三角瓶放于电位滴定仪的搅拌器上，打开搅拌器,然后用氢氧化钠进行滴定,当到达终点时,将自动停止滴定。

４.4 滴定的同时向三角瓶中吹氮气,防止溶液吸收空气中的二氧化碳。整个滴定过程应在1mｉn内完成。 4.5 记录消耗氢氧化钠的毫升数。

注：如没有电位滴定仪,可用pH计代替。步骤:首先校准ｐH计，然后将样品溶液放于磁力搅拌器上，用滴定管向三角瓶中滴加氢氧化钠溶液，直到ｐＨ值达到8.3０，以下步骤同4.4和4.5。 5. 结果计算

５.１ 原料奶或液态奶:

样品的滴定酸度(0Ｔ)＝

其中：

CV1_V0100

V0.1000C——氢氧化钠标准溶液的浓度,ｍoｌ/L Ｖ1——滴定时消耗的氢氧化钠的体积,mｌ V0--－-空白实验时消耗的氢氧化钠的体积,ｍl V--－-吸取样品的体积,ml

５．２ 酸奶类

样品的滴定酸度(0T）=

CV1_V0100

V0.1000

C—氢氧化钠标准溶液的浓度,mｏl/L V1——滴定时消耗的氢氧化钠的体积,ml Ｖ０－---空白实验时消耗的氢氧化钠的体积,mｌ m--－-称取样品的质量,g

５.3 奶粉:

样品的滴定酸度（0T）＝

C10V12

m1w)式中:c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，moｌ/L

V —— 滴定时消耗的氢氧化钠的体积，ｍｌ ｍ ——称取样品的质量,ｇ w ——样品中水分的质量分数，％

12 ——12ｇ乳粉相当10０ml复原乳(脱脂乳粉应为9,脱脂乳清粉为７) 以上滴定酸度结果保留至小数点后一位。

注:若以乳酸含量表示样品的酸度,则样品乳酸含量（g/100g)=T×0．０0９。T为样品的滴定酸度;0.009为乳酸的换算系数。 6． 允许差

本方法的重复性为由同一分析人员,同时或在短时间间隔内,对同一样品所做的两次单独实验的结果之差不得超过1.0 0T。 二、常规法 １. 原理

将一定量的乳或奶粉复原乳，以酚酞作指示剂,碱性品红或硫酸钴作参比颜色,用0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色，根据所消耗的毫升数可计算

出滴定100ｍl乳或干物质为1２％的复原乳，所需的氢氧化钠量。

所需氢氧化钠溶液的量随产品中的自然缓冲物质变酸或添加酸性或碱性物质的量而变化。 ２． 试剂

所有试剂,如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水,如未注明其他要求，均指三级水。

2.1 氢氧化钠标准溶液:ｃ（NaＯH)为0.1mol/l。配制和标定同基准法2.1。 2．２ 参比溶液

2.2.1 碱性品红溶液：将0．005g碱性品红溶于水中，并定容至１00ml。 2．２.２ 硫酸钴溶液:将3g七水硫酸钴溶于水中，并定容至１0０ｍｌ。 ２．3 酚酞溶液：同基准法２.2。 3. 仪器及器材 3.1 分析天平

3.2 半微量滴定管：10ml，分刻度为0．０5ｍｌ ３.3 吸管:0.５ml,2ml,1０ml 3．４ 量筒：２0ml，100ml 3.5 三角瓶:1５0ml，２５0ml 4. 操作步骤 ４.1样品处理

4.1．１ 原料奶和液态奶样品：吸取10ml原料奶或液态奶样品于三角瓶中，加入20mｌ无二氧化碳蒸馏水，同时做空白。

4.1．２ 酸奶类样品：准确称取5g左右样品于三角瓶中，加入4０ml40℃无二氧化碳蒸馏水,溶解,同时做空白。

４.１．３ 奶粉：称取4ｇ样品于三角瓶中,准确至１0ｍg。用量筒量取96mｌ 20℃的无二氧化碳水，使样品复原，剧烈搅拌，然后静置２０miｎ后,同时做空白。 4.2 标准颜色制备

4.２．1 液态奶样品:吸取10mｌ样品于150ml三角瓶中，加入20mｌ无二氧化碳水,加入3滴碱性品红溶液,摇匀。

4.2.２ 酸奶类样品: 称取5g左右样品于150ml三角瓶中，加入４０ml40℃无二

氧化碳水,溶解冷却后加入3滴碱性品红溶液,摇匀。

4.２．３乳粉：将乳粉按照4．１.３复原后，在溶液中加入2ml硫酸钴溶液,摇匀。

如果要测定一系列相似的产品,则以上两种标准色溶液可用于整个测定过程,但不得超过2ｈ. 4.3 样品滴定

４.3.１原料奶和液态奶样品：将样品按照4．1．1处理后，加入0.5ml酚酞溶液，摇匀。用滴定管向样品溶液中滴加氢氧化钠标准溶液，,边滴定边摇动三角瓶,滴定至初显粉红色,直到颜色与标准溶液的颜色相似，并在3０ｓ内不褪色。 4.３.2酸奶类样品：:将样品按照4.1.2处理后，加入0．5mｌ酚酞溶液，摇匀。用滴定管向样品溶液中滴加氢氧化钠标准溶液，,边滴定边摇动三角瓶，滴定至微红色，直到颜色与标准溶液的颜色相似,并在1mｉn内不消失为止。

4.３.3乳粉：将样品按照4.1．３复原后,在溶液中加入2ml酚酞溶液,摇匀。用滴定管向样品溶液中滴加氢氧化钠标准溶液，,边滴定边摇动三角瓶，直到颜色与标准溶液的颜色相似,且5s内不消褪。整个滴定过程应在45ｓ内完成。 4．4 记录所消耗的氢氧化钠标准溶液的毫升数。 5. 结果计算

5.1 原料奶或液态奶：

样品的滴定酸度(０T)＝

CV1_V0100

V0.1000

其中:

C——氢氧化钠标准溶液的浓度,ｍｏl／L V1——滴定时消耗的氢氧化钠的体积，ml V0-－－－空白实验时消耗的氢氧化钠的体积,ｍｌ Ｖ－---吸取样品的体积，mｌ

５.2 酸奶类

样品的滴定酸度(0T）＝

CV1_V0100

m0.1000——氢氧化钠标准溶液的浓度，ｍoｌ／L

V1——滴定时消耗的氢氧化钠的体积，mｌ V0－-－-空白实验时消耗的氢氧化钠的体积,ｍl m--－－称取样品的质量，g

5.3 奶粉类

样品的滴定酸度(0Ｔ)＝

式中:c ——氢氧化钠标准溶液的浓度，moｌ/Ｌ

V —— 滴定时消耗的氢氧化钠的体积，ml m ——称取样品的质量,g ｗ ——样品中水分的质量分数,%

１2 ——1２g乳粉相当１00ml复原乳（脱脂乳粉应为９，脱脂乳清粉为7)

以上滴定酸度结果保留至小数点后一位。

注：若以乳酸含量表示样品的酸度，则样品乳酸含量(g/100g)=T×0.０0９。Ｔ为样品的滴定酸度；0．009为乳酸的换算系数。 6． 允许差

本方法的重复性为由同一分析人员，同时或在短时间间隔内,对同一样品所做的两次单独实验的结果之差不得超过1.0 ０Ｔ。

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C10V12

m1w)

乳与乳制品常规理化指标检验

灰分的检测

YLNB 2.2

1． 原理

将一定量的样品经炭化后放入高温炉内灼烧,有机物中的碳，氢、氮被氧化分解，以二氧化碳、氮的氧化物及水等形式逸出，另有少量的有机物经灼烧后生成的无机物,以及食品中原有的无机物残留下来,这些残留物即为灰分。称量即可算出灰分含量。 ２. 仪器及器材 2.１分析天平。

2.2瓷坩埚:４0~6０mL。用清水清洗后,再用王水（１份硝酸：3份盐酸)浸泡1h,洗去酸液，至电炉上烧灼0.5ｈ，取出,称量，待用。 2.3电炉。

2．４高温炉:保持温度550℃左右。 ２.5干燥器：装有有效干燥剂。 2.6坩埚夹 3． 方法

3.１称取约3～5g样品(准确到0.2mｇ)于已准备好并已称量的坩埚中,置于电炉上初步灼烧,使之炭化至无烟。

3.2移入高温炉保持温度在５50±25℃左右，灼烧,使之成白灰(约２h）后，冷至

100~200℃后取出,放入干燥器中冷却至室温（约30mｉn)，称量。 ３．3重复3．２操作直至前后两次质量差不超过2mg。 4． 结果计算 样品中的灰分(%）=

m3m1100ﻩ m2式中： m１—空坩埚的质量，g; m2—样品的质量, g；

ｍ3—坩埚加样品灰化后的质量，g ; 结果精确至0.0１% 5. 允许差

同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的0．05%。 6. 注意事项

1) 严格控制灰化温度，温度过高，会引起钾、钠、氯等元素的损失,而且碳酸钙变成氧化钙、磷酸盐熔融，将炭粒包藏起来,使炭粒无法氧化，而温度过低,则灰化时间长，且易造成灰化不完全。

2) 灰化时间控制：灰化至白色或浅灰色,并恒重。但有些样品即使灰化完全,残灰也不一定是白色或浅灰色，如：含铁高的食品,显褐色；含锰、铜高的食品,显蓝绿色。所以要根据样品的组成、残灰的颜色，对灰化的程度作出正确的判断。

3） 灰化过程中,可加入蒸馏水,目的是把已灰化的物质溶解到坩埚底,使中间未灰化的物质漏出表面，易于灰化。具体操作:先灰化2—3h,冷却后，加少许蒸馏水，在水浴上蒸干,继续灰化。在用电炉炭化之前,可在样品中滴加无灰植物油数滴，以防样品膨胀而逸出。

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乳与乳制品常规理化指标检验

全脂乳固体检测 YLNB

2.３

1． 原理

用下列方法测得的,以质量分数表示的剩余的纯乳制品样品的质量。 2． 仪器和器材

２．1 干燥器：内置有干燥剂

２.2 带盖吕皿或带盖玻璃皿:直径50~7０mm 2.3 电热鼓风干燥箱 2.4 电热恒温水浴锅

2.5 短玻璃棒:长于皿盒的直径,可斜放到皿盒内,不影响盖盖。 2.６ 石英砂或海砂：通过下列适用性测试。

２．6．1 将约２0g的海砂同短玻璃棒一起放于一皿盒中，然后敞盖在102±２℃的烘箱中烘2h。把皿盒盖盖后放入干燥箱中冷却到室温后称量，准至０.１ｍg。 2.6.2 用5ml水将海砂润湿,用短玻璃棒混合海砂和水，将它们再次放入烘箱中烘４h。然后把皿盒盖盖后放入干燥箱中冷却到室温后称量，准至0.１mg。两次称量的差不应超过０.5mg。如果两次称量的质量差超过了0.5mg,则需对海砂进行处理后，才能使用。

处理海砂的方法：用水洗干净，用6NHＣl煮沸０.5h，洗至中性，再用６Ｎ N

ａＯH煮沸0.5h，洗至中性,干燥备用。（参考GB/Ｔ５００9） ３. 方法

３.1 皿盒的准备:在带盖的皿盒中加入约１０~20g干净的海沙和短玻璃棒,开盖在烘箱１0２±2℃中烘１ｈ，盖上盖迅速将皿盒移入干燥器内冷却至室温(至少45min），连海砂 、短玻璃棒一起称重，复烘至恒重。

3.2 称取乳样5g，与海砂混合、平铺在皿盒底上，沸水浴蒸干,一边蒸一边不断搅拌。擦净皿盒的外部，将皿盒的盖置于皿盒的一边放入烘箱中，在102±2℃烘2h，加盖取出，置于干燥器冷却45ｍin，称量。再将皿盒开盖放入烘箱中烘1h,加盖取出，冷却称量，如此反复,直至两次的质量差小于2mg为恒重,恒重后以最小称量质量为准．

4. 结果计算

W=

W:全乳固体的质量

m1:含有海砂的皿及样品质量 m2-:含有海砂的皿及样品干燥后质量 m3:含有海砂的皿质量

非脂乳固体的计算

乳中总固体的含量随乳成分的百分含量的变化而有所变动，尤其脂肪,是乳中一个不稳定的成分，对总固体的影响较大，所以实际中常用非脂乳固体作指标。

非脂乳固体是由测得的全脂乳固体质量分数和测得的脂肪质量分数计算得到的。

非脂乳固体=全脂乳固体—脂肪

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m2m3100

m1m3

乳与乳制品常规理化指标检验

总固形物的检测

ＹLNＢ ２.4

一、冷冻饮品 1． 原理

将试样在10２±２℃的鼓风干燥箱内加热至恒重,加热前后的质量差即为总固形物的含量。 2. 仪器和器材 ２.１ 分析天平

2.2 干燥器:内置有干燥剂。

2.3 鼓风干燥箱:可控制在１02±2℃。

２.4 称量皿：具盖，直径为5０~70ｍm，高为20~３0mm。 2.5 电热恒温水裕锅。

2.６ 平头玻璃棒:棒长不超过称重皿的直径。 2.7 海砂:：通过下列适用性测试。

2．７.1 将约２０g的海砂同短玻璃棒一起放于一皿盒中，然后敞盖在102±2℃的烘箱中烘２h。把皿盒盖盖后放入干燥箱中冷却到室温后称量,准至0.1ｍg。 ２.7.２ 用5ｍl水将海砂润湿，用短玻璃棒混合海砂和水,将它们再次放入烘箱

中烘4h。把皿盒盖盖后放入干燥箱中冷却到室温后称量，准至0.1mg。两次称量的差不应超过０.5mｇ。

如果两次称量的质量差超过了0．5mg,则需对海砂进行处理后，才能使用: 用水洗干净，用6NＨCｌ煮沸０.5h,洗至中性，再用6N NaOH煮沸0.5h，洗至中性，干燥备用。（参考GB/T500９） ３. 试样的制备 3.1 清型

取代表性的样品至少200g,置于300ml烧杯内，在室温下融化,充分搅拌均匀。 3．2 混合型

取代表性的样品至少200g，在室温下融化,用组织捣碎机捣碎均匀。 3.3 组合型

取代表性的样品的主体部分至少２00g,在室温下融化。 ３.4 将以上制备的试样立即倒入广口瓶内,盖上瓶盖备用。

3.5 如样品粘度大,可先将盛有样品的烧杯置于30~40℃的电热恒温水裕锅内进行搅拌。 ４. 方法

4.１ 称量皿和海砂的干燥

用称量皿称取海砂约1０－20g，将玻璃棒放在称量皿内,连同皿盖置于1０2±2℃鼓风干燥箱内，加热1h，加盖取出，置于干燥器内冷却室温,称量，精确至０．001g，重复干燥直至恒重。 ４．2 试样的称取

用称量皿称取试样5-1０g,精确至0.0０1g。应先将水分蒸发后再放入烘箱中，并将玻璃棒放入称量皿内。 4.3 试样的烘干

将盛有试样、玻璃棒的称量皿置于102±2℃鼓风干燥箱内（皿盖斜放在皿边）,加热约2.5h，加盖取出，置于干燥器内冷却45min，称量,重复加热0.5h,直到连续两次称量差不超过0.002g，即为恒重,以最小称量质量为准。 5. 结果计算

总固形物含量以质量百分率表示，按式(1）计算:

Ｘ(%)=

式中：X—试样中总固形物的含量。

m—海砂、称量皿、皿盖和玻璃棒的质量,g; m1—海砂、试样、称量皿、皿盖和玻璃棒的质量，g;

m２—烘干后海砂、残留物、称量皿、皿盖和玻璃棒的质量,g； ６.允许差

同一样品两次测定结果之差，不得超过平均值的5%。 二、酸奶类制品 1. 原理

将试样在10２±2℃的鼓风干燥箱内加热至恒重,加热前后的质量差即为总固形物的含量。 2. 仪器和器材 2.1 分析天平

2.2 干燥器：内置有干燥剂。

２.3 鼓风干燥箱:可控制在１02±2℃。

2.4 称量皿：具盖,直径为5０-７0mm，高为２０-30ｍm。 ２.5 电热恒温水裕锅。

2.６ 平头玻璃棒：棒长不超过称重皿的直径。 2.7 海砂::通过下列适用性测试。

２.7.1 将约2０g的海砂同短玻璃棒一起放于一皿盒中，然后敞盖在102±2℃的烘箱中烘2h。把皿盒盖盖后放入干燥箱中冷却到室温后称量，准至0.１mｇ。 ２.7．２ 用5ml水将海砂润湿,用短玻璃棒混合海砂和水，将它们再次放入烘箱中烘４ｈ。把皿盒盖盖后放入干燥箱中冷却到室温后称量，准至0.1ｍg。两次称量的差不应超过０．5mｇ。

如果两次称量的质量差超过了0.５mg，则需对海砂进行处理后,才能使用： 用水洗干净，用６NHCl煮沸0.５ｈ，洗至中性，再用６N ＮaOH煮沸0.5h,洗至

m2m100

m1m中性，干燥备用。(参考ＧB/T5009）

3.样品处理:如样品粘度大，可先将盛有样品的烧杯置于3０-４０℃的电热恒温

水

浴锅内进行搅拌。 4. 方法

4．１ 称量皿和海砂的干燥

用称量皿称取海砂约10-２0ｇ，将玻璃棒放在称量皿内，连同皿盖置于１02±2℃鼓风干燥箱内，加热1ｈ，加盖取出，置于干燥器内冷却室温，称量,精确至0．001g，重复干燥直至恒重。 ４.2 试样的称取

用称量皿称取试样约5g,精确至０.001ｇ。用玻璃棒将海砂和试样混合,并将玻璃棒放入称量皿内。 4.3 试样的烘干

将盛有试样、玻璃棒的称量皿置于102±2℃鼓风干燥箱内（皿盖斜放在皿边），加热约2．５h，加盖取出，置于干燥器内冷却4５mｉn,称量,重复加热0．５ｈ,直到连续两次称量差不超过0.002g,即为恒重，以最小称量质量为准。 5．分析结果的表述

总固形物含量以质量百分率表示,按式（1）计算:

X（%)＝

m2m100

m1mﻩ式中：X—试样中总固形物的含量。

m—海砂、称量皿、皿盖和玻璃棒的质量，g; m1—海砂、试样、称量皿、皿盖和玻璃棒的质量,g;

ｍ2—烘干后海砂、残留物、称量皿、皿盖和玻璃棒的质量,ｇ；

非脂乳固体的计算

乳中总固体的含量随乳成分的百分含量的变化而有所变动，尤其脂肪，是乳中一个不稳定的成分，对总固体的影响较大，所以实际中常用非脂乳固体作指标。

针对酸奶类样品非脂乳固体是由测得的总固形物质量分数和测得的脂肪质量分数及乳中添加的蔗糖的质量分数计算得到的。

非脂乳固体=总固形物—脂肪—蔗糖

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乳与乳制品常规理化指标检验

水分的检测

ＹＬNB 2.5

１. 原理

将样品放入1０2±2℃的烘箱中加热,直到恒重,所失去的质量即为水分含量 2. 仪器及器材

2.1 分析天平:灵敏度为0.１mg。

２.2 适当的皿：最好是铝，镍，不锈钢或玻璃皿,配有移动盖,直径为50—70mm,高度为25mm。

2.3 干燥器:配有有效干燥剂。

2．4 鼓风式烘箱：可控制恒温在10２±2℃,烘箱中的温度应均匀。 ２．5 带密封盖的瓶子:用于混合奶粉。 3. 方法

３.１ 样品的制备

将样品全部转入两倍于样品体积的干燥、带盖的瓶中，旋转振荡，使之充分混合(在此步骤中，不可能得到完全均匀的样品，必须在样品瓶中的相距较远的两

点,取两份样品,平行分析）。 3.２ 测定

3.２.1 将皿和盖(不要放在皿上)放入102±2℃的烘箱中,加热１h，加盖，然后将皿移入干燥器中,冷却至室温,称量。

3.2.2 将约3~5g样品放入皿中，加盖,迅速准确称量。

3.2.3 将皿和盖（不要放在皿上）放入102±2℃的烘箱中，加热3h。 3.2．4 加盖,将皿移入干燥器中,冷却至室温,并迅速准确地称量。

3.2.5 再将皿和盖（不要放在皿上）放入１０2±2℃的烘箱中，加热1ｈ。加盖后移入干燥器中，冷却至室温,称量。

3.２.６ 重复上述操作，直到两次连续称量质量之差不超过0.00０5ｇ。

3. 结果计算

样品的水分含量(%）=

m1_m2100 m3

式中:m1— 加入样品后皿和盖的最初质量，g；

m2— 样品烘干后两次称量获得的较小的质量，g; m3— 样品的质量，g。 4. 允许差

两次测得的结果的最大偏差不得超过0.0５%。

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乳与乳制品常规理化指标检验

脂肪的检测 YLNB 2．6 1. 范围

本方法规定了脂肪测定的基准方法。

本方法适用于乳粉、液体奶、婴儿配方食品、炼乳、稀奶油和奶油、冰淇淋样品中脂肪的测定。 2. 原理

样品用浓氨水和乙醇处理,氨水使酪蛋白钙盐变成可溶解的盐，促进脂肪球和乙醚的作用；加入乙醇使一系列的能被酒精浸出的物质留在水相中。然后利用乙醚提取试样中脂肪。加入石油醚使乙醚不被水饱和，并使分层清晰。将醚层倒入脂肪收集瓶中后使乙醚和石油醚挥发掉，就可得到剩在收集瓶中的脂肪的重量。 3． 试剂

所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所用实验用水,如未注注明其他要求，均指三级水。

按5.4规定的步骤进行空白试验，检验试剂的纯度。按5.1的操作准备一空的脂肪收集瓶用来校正环境的影响。试剂残余物含量不得大于0．5ｍg（见

８．1）。

如果全部试剂空白残余物大于0．5ｍｇ,则分别蒸馏１00ml乙醚和石油醚,测定溶剂残余物的含量。用空的控制瓶测得的量和每种溶剂的残余物的含量都不应超过0.5ｍg。若超过0．５ｍg，则应更换不合格的试剂，或对试剂进行提纯。 3.1 淀粉酶

3．2 氨溶液:质量分数约25%,ρ2０约910g/L。

注：如果买不到此浓度的氨溶液,可使用已知的、更大浓度的氨溶液。 ３.3 乙醇或由甲醇变性的乙醇:体积分数至少为９4%(8.5)。 3.4 刚果红溶液:1g刚果红溶于水中,稀释至10０ｍL。

注:可选择性地使用。刚果红溶液可使溶剂和水相界面清晰(见5.５.４），也

可使用其他能使水相染色而不影响测定结果的溶液。

3.5 乙醚：不含过氧化物(见8.3）,不含抗氧化剂，或抗氧化剂含量不大于2ｍg/kg，并满足空白试验的要求(见8.1和8.４) 3．6 石油醚：沸程30-6０℃。

3.7 混合溶剂：等体积混合乙醚（３.5)和石油醚（3．６），使用前配制。 ３.8 氯化钠溶液:20g/L，将20g 氯化钠溶于水中,稀释至10０0mＬ。 4. 仪器及器材

由于测定中使用了挥发性可燃溶剂,所有电器的使用均按照这些溶剂使用的有关规定进行。 4.1 分析天平

4.２ 离心机：可安放脂肪瓶或管(4．6)转速为５00-６00r/min，可在抽脂瓶外端产生80-90g的重力场。

注：可选择性使用

4.3蒸馏器或蒸发器：可在不超过100℃情况下，蒸馏除掉脂肪收集瓶中的溶剂和乙醇，或蒸发除掉烧杯或平皿中的溶剂和乙醇(5.5.7,5.5.11)。 4.４ 烘箱：温度可控制在102±2℃。 4.5 水浴：温度可控制在６5℃±５℃。

4.6 毛氏抽脂瓶:抽脂瓶应带有适当的优质软木塞或其他不影响溶剂使用的瓶塞(如硅胶或聚四氟乙烯）。软木塞应先浸于乙醚中(３.5）,后放入60或６0℃以上

的水中保持至少15miｎ，然后在水中冷却，使用时木塞已饱和，不用时要一直浸泡在水中，浸泡用水每天更换一次。 ４.7 支架：放置抽脂瓶。

4.８ 洗瓶:适合装混合溶剂（3．7)。不能使用塑料洗瓶。

４.9 脂肪收集瓶:例如：容量为１2５－250ｍl可加热烧瓶（平底烧瓶）,１５0ｍｌ锥形瓶或金属皿。若使用金属皿，最好为不锈钢、平底、有溢流口的、直径为８０-１00mm，高约50ｍm。

4.10 沸石：无脂肪、无气孔的瓷片或碳化硅或玻璃珠(用金属皿的情况下）。 ４．1１ 量筒：5ml和25ml。 4.１2 吸量管:1０mｌ刻度吸管。

4.1３ 金属夹钳：用于夹烧瓶、烧杯和皿。

４.14 毛氏抽脂瓶摇混器:可夹放毛氏抽脂瓶,摆动频率为１00±１0次/ｍin。 ５. 方法

５.1 脂肪收集瓶的准备

于干燥的脂肪收集瓶（4.9)中加入几粒沸石(4．10)，放入烘箱(4.４）中干燥1ｈ。使收集瓶冷却(防尘）至天平室的温度(玻璃收集瓶至少需要1h，金属皿至少0.5h)。

注:１．去除溶剂过程中，特别是使用玻璃收集瓶时，沸石可以使沸腾均匀。

用金属皿时,也可选择地使用沸石。

2 ．收集瓶不可放入干燥器中,避免冷却不充分或冷却时间过长。

5．2 样品的制备

反复转动样品容器，使样品充分混合（必要时，将实验样品全部移入大的密闭容器中之后，再进行此操作）。 5.3 样品的称取和抽提准备

５．３.1 鲜乳,液体乳，脱脂乳等液体样品

５.3.1．1 用１0ml或10.7５ml吸管将样品移入小烧杯中，置于分析天平上用减量法称取10－11ｇ,准确至0.1mg,移入毛氏抽脂瓶。

５.3．1.２ 加入2ml氨溶液（3.2)或同体积的浓氨溶液(见3．2注)，在小球中与样品充分混合。加入氨水后,应马上进行下一步骤。

5.3.2 粉类样品

５.3.2．1 轻轻搅拌或转动样品容器,以便混合实验样品（5.1)，立即取样,直接放在抽脂瓶(4．6）或其他容器中,精确至0.1ｍg,取样量如下： a) 高脂乳粉、全脂乳粉、全脂加糖乳粉和配方乳粉：约1ｇ。 b) 部分脱脂乳粉、乳清粉、酪乳粉：约1.5ｇ。 c) 含乳婴儿谷物（配方)食品:约1.5g。

５.3.2．２ 用1０mｌ 65℃±5℃的水，将试样洗入抽脂瓶的小球中，充分混合，直到样品完全溶解，放入流动水中冷却。

５.3.2．3 加入２ml氨溶液（３.２）或同体积的浓氨溶液(见3.2注),在小球中与样品充分混合。

5.3.2.４ 将抽脂瓶放入65℃±５℃的水浴(４.５）中,加热1５-２０mｉn,时而振荡一次，取出,冷却至室温。 5.3.3 炼乳样品和粘性样品:

5.3．3.1 在小烧杯中称取4-5ｇ淡炼乳，或2.0-２.5g甜炼乳样品,精确至０.1ｍg。

5.3．3.2 用８-1０ml约５０℃的热水将样品洗入抽脂瓶中,使水和样品的总体积为10~11mｌ,充分混合,放入流动水中冷却。

5.3.３.3 加入2ml氨溶液（３.2)或同体积的浓氨溶液（见３.2注），在小球中与样品充分混合。

5.３．4 稀奶油和奶油样品

５.3.4.1 称取脂肪量为0.3-０.6g的样品,精确至0.1ｍg。用减量法在抽脂瓶中直接称取样品，要尽量将样品移入小球内,避免附着在瓶壁上。

5.3.4.2 加入约50℃的热水，使水和样品的总体积为1０-1１ml,在小球内充分混合,放入流动水中冷却。

5.３．4．3 加入2ml氨溶液（３.２）或同体积的浓氨溶液（见3．2注)，在小球中与样品充分混合。 5.３.5 冰淇淋样品

5.3．５.１ 称取脂肪量为0.3-０.6g的样品,精确至0.１mg。用减量法在抽脂瓶中直接称取样品,要尽量将样品移入小球内,避免附着在瓶壁上。

5.3.5.２ 加入约50℃的热水,使水和样品的总体积为１0－11m，在小球内充分混合,放入流动水中冷却。

5.3.5.３ 在抽脂瓶内加入氯化钠溶液（3．8）2ml，小心混合，然后加入2ｍl氨溶液(３.2)或同体积的浓氨溶液（见3.2注)，在小球中与样品充分混合。 ５．３.5.4 将抽脂瓶放入65℃±5℃的水浴（4.5)中,加热１5－20min,时而振荡一次,取出，冷却至室温。 5．3.6 含淀粉的样品

5.３.6.1 在抽脂瓶中直接称取约1ｇ样品，精确至0.１mg。

５．3.6.2 加入约0.１g的淀粉酶和一小磁性搅拌棒,混合均匀后,加入８－10ml 45℃的蒸馏水,注意液面不要太高。

5.3.6.3 将抽脂瓶盖上瓶塞于搅拌状态下，置65℃±5℃水浴中2h，每隔１0min摇混一次。检查淀粉是否水解完全:加入两滴约0.1mol／L的碘溶液,无蓝色出现，水解完全,否则将抽脂瓶重新置于水浴中，直至无蓝色出现。

5.３.6.4 冷却毛氏抽脂瓶，加入２mｌ氨溶液(3.2)或同体积的浓氨溶液(见３.2注),在小球中与样品充分混合。 ５.4 空白试验

空白试验与样品检验同时进行,使用相同步骤和相同试剂，但用10ｍL水代替已稀释的样品。 5.5 测定

５.５.1 加入10mＬ乙醇(3.3）轻轻地使内容物在小球和柱体间来回流动，和缓但彻底地进行混合，避免太接近瓶颈,然后加入2滴刚果红溶液（3.4)

注:冰淇淋样品若出现结块,必须重新测定。

5.5.２ 加入25ｍL乙醚(3.5)，塞上被水饱和的软木塞（见４.6）,或用水浸湿的其他瓶塞，将抽脂瓶保持在水平位置，小球的延伸部分朝上夹在摇混器上,按约100次／miｎ振荡烧瓶１mｉn,不要过渡(避免形成持久乳化液)。必要时将抽脂瓶放在流水中冷却,然后小心地打开塞子，用少量的混合溶剂（3.7)冲洗塞子和瓶颈 ［冲洗时使用洗瓶(4．８)]，使冲洗液流入抽脂瓶或已准备好的脂肪收集瓶中(5．1）。

注:如没有摇混器,可用手进行振荡。

5.５.３ 加入25ｍL石油醚(３.６)，塞上重新润湿的塞子(浸入水中),接5.5．２所述，轻轻振荡3０s。

5．5.4 将加塞的抽脂瓶放入离心机(4.2)中，在５00-600r/mｉn下离心１-５miｎ。如果没有离心机,则将抽脂瓶放到支架上（4．7），静止至少３0min,直到上层液澄清,并明显与水相分离。必要时，放在流水中冷却抽脂瓶。

5．５.5 小心地打开软木塞或瓶塞,用少量的混合溶剂冲洗塞子和瓶颈内壁,使冲洗液流入抽脂瓶或脂肪收集瓶中。

如果两相界面低于小球与瓶身相接处,则沿瓶壁边缘慢慢地加入水,使液面高于小球和瓶身相接处，以便于倾倒。

５.5.6 持抽脂瓶的小球部，小心地将上层液尽可能地倒入已准备好的含有沸石的脂肪收集瓶中,避免倒出水层。

5．5.7 用少量混合溶剂冲洗瓶颈外部，冲洗液收集在脂肪收集瓶中。小心操作，以防溶剂溅到抽脂瓶的外面。

按5．5.11所述,采用蒸馏或蒸发的方法，去除脂肪收集瓶中的溶剂或部分溶剂。

５.5．８ 向抽脂瓶中加入５mL乙醇(３.３），用乙醇冲洗瓶颈内壁,按5.5.１所述进行混合。

5.５.9 重复5.5．２-5．5.７操作,进行第二次抽提,但只用1５ｍL乙醚(3.5)和１５mL石油醚（3.6),用混合溶剂（3.7）冲洗瓶颈内壁。

5.5.１0 重复5.5.2-5.5.7操作，进行第三次抽提,但只用１５mL乙醚(3.５）和１5ｍＬ石油醚（3.６)，用混合溶剂（3.7)冲洗瓶颈内壁。

５．5.11采用蒸馏的方法去除收集瓶中的溶剂（包括乙醇），对烧杯或皿可用蒸发(4.3)来除去溶剂。蒸馏前用少量混合溶剂（３．7)冲洗瓶颈内部。 ５.５.１2 将脂肪收集瓶放入102℃±2℃的烘箱（４.４）中加热1ｈ，取出收集瓶,冷却至天平室的温度(不要放入干燥器中，但要放防尘，玻璃容器冷却至少1h，金属容器冷却至少0.5h)。称量,精确至0．1mg。称量前不要擦收集瓶。用夹钳将收集瓶放到天平上（避免温度变化)。

5.5．1３ 重复5.5.1２操作,直到脂肪收集瓶两次连续称量不超过0．5mg,记录收集瓶和抽提物的最低质量。

5．5．14 为验证抽提物是否全部溶解,向脂肪收集瓶中加入25mＬ石油醚，微热,振摇，直到脂肪全部溶解。

如果抽提物全部溶入石油醚中,则含抽提物的收集瓶的最终质量（见５.5.13)和最初质量（见5.１）之差,即为脂肪含量。

5．5.1５ 如抽提物未全部溶解于石油醚中,或怀疑抽提物是否全部为脂肪，则用热的石油醚洗提。允许微量的不溶物质沉淀。小心地倒出石油醚,不要倒出任何不溶物，重复此操作3次以上,再用石油醚冲洗收集瓶口的内部。

最后，用混合溶剂冲洗收集瓶口的外部,避免溶液溅到瓶的外壁。将脂肪收集瓶放入1０2℃±２℃的烘箱（４.4)中，加热1h,按５.５.1２和5.5．１3所述去除石油醚,冷却,称量。

取５．５.1３中测得的质量和5.5.15测得的质量之差作为脂肪的质量。 ６. 结果计算

样品中脂肪的含量（g/100g）＝

m1m2m3m4m0100

式中:m0—样品的质量（5.3)，g；

ｍ1— ５.5.13中测得的脂肪收集瓶和抽提物的质量,g;

m2—脂肪收集瓶的质量(5．１），或在有不溶物存在下,5.５．１5中测得的

脂肪收集瓶和不溶物的质量，g;

ｍ３—空白试验（5.4)中,脂肪收集瓶和5.5.1３种测得的抽提物的质量,g； ｍ4—空白试验(5.4）中脂肪收集瓶（见５.１）的质量,或在有不溶物存在

时，５.5.15种测的的脂肪收集瓶和不溶物的质量，g。 报告质量分数结果精确至０．01% 7． 允许差 7.1重复性

在短时间间隔内,同一分析人员对同一样品进行的两次单独试验的结果差,应不得超过下列值：

—生鲜乳和加工乳: 0.02% —脂肪含量为0.5~2%的液体乳产品： 0.０２% —脂肪含量＜0．5%的液体乳产品:

0.01%

—高脂和全脂奶粉:0ﻩ.２0% —部分脱脂奶粉和酪乳粉：0.1ﻩ５% —脱脂奶粉和乳清粉：

０.10%

—脂肪含量＞5%的乳基婴儿食品: ０.20% —脂肪含量等于和小于5%的乳基婴儿食品:0ﻩ．１0% —液体乳基婴儿食品： 7.2 重现性

不同实验室两个分析人员对同一样品进行的两次独立试验的结果之差，应不得超过下列值:

—生鲜乳和加工乳: 0．04% —脂肪含量为0．5~2％的液体乳产品: 0.0３% —脂肪含量＜0.5%的液体乳产品:0ﻩ．025% —高脂和全脂奶粉: —部分脱脂奶粉和酪乳粉： —脱脂奶粉和乳清粉:

０.3０% 0.25% ０．20% ０.0５%

—脂肪含量＞5%的乳基婴儿食品： ０.4０％ —脂肪含量等于和小于５%的乳基婴儿食品:0.20ﻩ％ —液体乳基婴儿食品：0ﻩ.１0% 8. 注意事项

8.1 空白试验检验试剂

在进行空白试验时,使用相同的质量控制瓶，以消除环境及温度对检验结果的影响。

在极其偶然的情况下，溶剂中可能会有易溶于脂肪的挥发性物质，此时应对所有试剂做空白试验。进行空白试验时在脂肪收集瓶中放入1g新鲜的无水奶油。必要时，于每10０mＬ溶剂中加入1ｇ无水奶油后重新蒸馏，重新蒸馏后必须尽快使用。

8．2 空白试验与样品测定同时进行

对于存在非挥发性物质的试剂可用与样品测定同时进行的空白试验值进行校正,抽脂瓶与天平室之间的温差可对抽提物的质量产生影响（5.５.1３和5.１或

5.5.1５）。在理想的条件下（试剂空白值低,天平室温度相同，脂肪收集瓶充分冷却)，该值通常小于0.５mg。在常规测定中,可忽略不计。若此值稍高（±２.5mg),一般也可忽略不计,校正之后，结果仍可准确的，但当校正值大于2．５mｇ时,检验报告中应予以说明。

如果空白试验值经常超过0.5mg，且近期没有对试剂进行检验,则应马上对试剂进行检验，更换或提纯任何不纯的试剂。

8．3 乙醚、石油醚必须彻底挥发，否则放入烘箱中有爆炸的危险。实验必须在通风橱内完成,且周围不能有明火。

8.4 脂肪接收瓶反复加热，会因脂类氧化而增重。在恒重过程中，如质量增加，应以增重前的质量为恒重。对脂肪含量高的样品,可在真空烘箱中进行干燥，可避免因脂肪氧化所造成的误差。

8．５ 抽提所用的乙醚、石油醚要求无水、无醇、无过氧化物,因水和醇会导致糖类及水溶性盐类等物质的溶出，使测定结果偏高。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时还有引起爆炸的危险。 8．6 乙醚中过氧化物的检验

取一只具玻璃塞小量筒，用乙醚冲洗,然后加入10mＬ乙醚,再加入１mL新制备的100g/L的碘化钾溶剂,振荡,静止1min，两相中均不得有黄色。

也可使用其他适当的方法检查过氧化物。

在不加抗氧化剂的情况下，为长久保证乙醚中无过氧化物,使用前三天按下法处理:

将锌箔削成长条，长度至少为乙醚瓶的一半，每升乙醚用80cm２锌箔。 使用前，将锌片完全浸入每升中含有10ｇ五水硫酸铜和２mL质量分数为９8%的浓硫酸溶液中1miｎ,用水轻轻彻底地冲洗锌片,将湿的镀铜锌片放入乙醚瓶中即可。也可以使用其他方法,但不得影响检测结果。 8．7 乙醚中含抗氧化剂的情况

如果每1kg乙醚中约含１ｍg抗氧化剂，不影响使用。如乙醚中含有较高的抗氧化剂,例如：每千克中含有7mｇ抗氧化剂,此种醚仅用于常规测定，并且空白试验与样品测定要同时进行,以校正抗氧化剂残留引起系统误差。若用于基准法测定,使用前应重新蒸馏。

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乳与乳制品常规理化指标检验

乳糖、蔗糖和总糖的检测 YLＮＢ 2.7 一、高压液相色谱法（ﻩ仲裁法) １. 原理

食品中的多种糖，可利用高压液相色谱法的μ-碳水化合物柱或氨基柱将它们分离，用示差折光检测器,检出各糖液的折光指数,此折光指数与其浓度成正比。 2． 试剂

所有试剂,如未注明规格,均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

２．１澄清剂：硫酸铜,质量分数7%。氢氧化钠,质量分数４%。 2．2乙腈。 2．3标准溶液

2.３．1标准糖贮备液，10mg/mｌ。

精确称取被测糖的标样1ｇ，溶于水中,用水稀释至100mｌ容量瓶内,定容。 2.3.2标准糖工作液,4 mg/ml。

吸取４ml贮备液,置10mｌ容量瓶中,用乙腈稀释至刻度。 3． 仪器

高压液相色谱仪,带碳水化合物分析柱或氨基柱。 4. 方法 4．1 样液制备

精确称取２ｇ左右奶粉或15ｇ左右液态奶样品,加３０ml水溶解，移至１00ml容量瓶中,加澄清剂硫酸铜(４.1)10ml，氢氧化钠(4.1)4mｌ,振摇，加水至刻度,静置半小时，过滤。取４ml样品母液置1０ml容量瓶用乙腈定容,通过０.45uｍ过滤器过滤，滤液备用。 ４．2 高压液相色谱仪工作条件： 示差折光检测器：氨基柱 流动相：乙腈／水=6/４ 流动相流速:1.０ｍl／min 4.3 进样

在仪器稳定后,用注射器或进样阀注射５0uL标准样液共4次,记下保留时间,测定峰高,放弃第一次数据,取后三者平均峰高值,同样注射样品50ul四次得出平均峰高。 5． 结果计算

样品中糖含量（g／100g)=

CH25CH100 （1）

4mHmH100010100式中： Ｃ1— 标准糖溶液浓度，ｍｇ/ml;

H— 样品中糖的平均峰高; Ｈ1— 标准糖溶液的峰高； m — 样品的质量,g 。

注：如果需同时测定样品中所含其他糖类,可在标准糖溶液中加入各种糖1g，进样如前,记下各种糖保留时间,按上列公式计算各值。 ６． 允许差

同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5％。

方法二 乳糖、蔗糖和总糖的测定(莱因—埃农氏法） 1．方法提要

乳糖：样品经除去蛋白以后,在加热条件下,直接滴定已标定过的费林氏液,样液中的乳糖将费林氏液中的二价铜还原为氧化亚铜。以次甲基蓝为指示剂，在终点稍过量时,乳糖将蓝色的氧化型次甲基蓝还原为无色的还原型次甲基蓝。根据样液消耗的体积,计算乳糖含量。

蔗糖:样品除去蛋白质后,其中蔗糖经盐酸水解转化为具有还原能力的葡萄糖和果糖，再按还原糖测定。将水解前后转化糖的差值乘以相应的系数即为蔗糖含量。

总糖:乳糖和蔗糖之和。 2． 试剂

所有试剂,如未注明规格，均指分析纯;实验室用水,如未注明其他要求,均指三级水。

2.1费林氏液（甲液和乙液）

2．1．1甲液：取３4.6３９ｇ硫酸铜，溶于水中，加入0．5ml浓硫酸,加水至５0０ml。

2.1.2乙液：取173g酒石酸钾钠及50g氢氧化钠溶解于水中,稀释至５0０ｍｌ，静置两天过滤。

2.2次甲基蓝溶液:10g／L。 2.3盐酸溶液:体积比１：1。

2.４酚酞溶液：0.５g酚酞溶于75ml体积分数９５%的乙醇中,并加入２0ml水，然后再加入约0.1mol／L的氢氧化钠溶液，直到加入一滴立即变成粉红色,再加入水定容至10０mｌ。

2.5氢氧化钠:c（NaOＨ）为30０ｇ/Ｌ。取300ｇ氢氧化钠,溶于10０0 ml水中。 2.6乙酸铅溶液：c(PｂＡc2)为200g/L。取２0g乙酸铅,溶解与100 ml水中。 2．７草酸钾—磷酸氢二钠溶液:取草酸钾3g，磷酸氢二钠７ｇ，溶解于100mL水中。 3. 仪器

常用理化实验室仪器。 4. 方法及结果计算 ４.1费林氏液的标定 4.1.1用乳糖标定

4.１．1.1称取预先在9２~9４℃烘箱中干燥2h的乳糖标样约0.75g(准确到０．2mg),用水溶解并稀释至２50ml。将此乳糖溶液注入一个50ml滴定管中,待滴定。

4.１.１.2预滴定:取10ml费林氏液（甲、乙液各5ml)于250ml三角烧瓶中。再加入20mｌ蒸馏水,从滴定管中放出15ml乳糖溶液于三角瓶中,置于电炉上加热,使其在2min内沸腾,沸腾后关小火焰,保持沸腾状态１5s,加入3滴次甲基蓝溶液（2.2)，继续滴入乳糖溶液至蓝色完全褪尽为止,读取所用乳糖的毫升数。 4.１.1.３精确滴定：另取1０ml费林氏液（甲、乙液各５ml)于２50ml三角烧瓶中，再加入2０ｍl蒸馏水,一次加入比预备滴定量少0.5～1.0ml的乳糖溶液置于电炉上,使其在２ｍin内沸腾,沸腾后关小火焰,保持沸腾状态2min, 加入３滴次甲基蓝溶液（2.２），继续滴入乳糖溶液(一滴一滴徐徐滴入),待蓝色完全褪尽即为终点。以此滴定量作为计算的依据（在同时测定蔗糖时,此即为转化前滴定量)。 4.１．1．4按(２)、(3)计算乳糖测定时,费林氏液的乳糖校正值(f1）：

A1V1m110004V1m1－--－－-－-－-－--－--－－-－-－---(2）

2504V1m1－--－--－-----－-－---------－------－－－--－（3）

AL1f1

式中:A1—实测乳糖数,ｍg； V1—滴定时消耗乳糖液量,ml；

m1—称取乳糖的质量,ｇ；

AL１—由乳糖液滴定毫升数查表1所得的乳糖数，mg。 4.1．２用蔗糖标定

4.１.2．1称取在1０5℃烘箱中干燥２h的蔗糖约０.2g(准确至０．2mg)，用5０ｍl水溶解并洗入100ml容量瓶中，加入1０ml水，再加入10ｍｌ盐酸(２．3）,置75℃水浴锅中,时时摇动,在2mｉn30s到2mｉn45s之间，使瓶内温度升到67℃。自达到６7℃后继续在水浴中保持5min,于此时间内使其温度升至6９．5℃,取出，用冷水冷却,当瓶内温度冷却至35℃时,加2滴酚酞指示剂（2.4)，用300ｇ/l的氢氧化钠（2.5）中和至呈中性。冷却至20℃，用水稀释至刻度，摇匀。并在此温度下保温30mｉn后在按4.1.１.2和４．1．1．3操作。得出滴定１０ml费林氏液所消耗的转化糖量。

4.1.２．２按式（4）(5)计算蔗糖测定时，费林氏液的蔗糖校正值（ｆ２):

A2V2m2100010.5263V2m2-－------－-－-－-－－----（４）

1000.95f210.5263V2m2 -－－－-－-－----－-－---－－-------－－------AL2（５）

式中:A 2—实测转化糖数,mｇ； V2—滴定时消耗蔗糖液量，ml；

ｍ ２—称取蔗糖的质量,g;

AＬ１—由蔗糖液滴定毫升数查表1所得的转化糖数,mg。 ４.2 乳糖的测定 4.2.1样品处理

4.2.1.1称样:乳粉称取2-3g（牛乳、花色奶：１７-1８g;酸乳样品:10-12ｇ) (准确至0.０１g),用１0０ml水分数次溶解并洗入250mｌ容量瓶中。

4.2.１．２加4mｌ乙酸铅(2.6)、４ｍl草酸钾—磷酸氢二钠溶液,每次加入试剂时都要徐徐加入，并摇动容量瓶，用水稀释至刻度。静止数分钟，用干燥滤纸过滤，弃去最初２5ml滤液后，所得滤液做滴定用。 ４.２.2滴定

４．2.２.1预滴定:将此滤液注入一个５0ml滴定管中，待测定。取１0ml费林氏液(甲、乙液各５ml）于２５０ml三角瓶中，再加入20ｍL蒸馏水，在三角瓶中放入１5mL滤液，置于电炉上,使其在2ｍin内沸腾,沸腾后关小火焰,保持沸腾状

态15s，加入３滴次甲基蓝(2.2），混匀，然后徐徐滴入乳糖溶液至蓝色完全褪尽为止，读取所用乳糖的毫升数。

4.２.２.2精确滴定:另取10ml费林氏液(甲、乙液各５ml)于250ml三角瓶中，再加入2０mL蒸馏水,一次加入比预备滴定量少０．5-１．0ml的乳糖溶液,置于电炉上,使其在２min内沸腾,沸腾后关小火焰，保持沸腾状态2min,加入3滴次甲基蓝（2.2），然后一滴一滴徐徐滴入乳糖溶液至蓝色完全褪尽即为终点,以此滴定量作为计算的依据（在同时测定蔗糖时，此即为转化前滴定量)。 ４.2．3乳糖含量的计算

LF1f10.25100－－-－-----－---－-－---（6)

V1m式中：Ｌ—样品中乳糖的质量分数，g/10０g

F1——由消耗样液的毫升数查表1所得乳糖数,ｍg； f1—费林氏液乳糖校正值;

ﻩV１—滴定消耗滤液量，ml

ｍ—样品的质量，g。 4.3 蔗糖的测定

４.3.１转化前转化糖量的计算

利用测定乳糖时的滴定量,自表1中查出相应的转化糖量，按式(7）计算:

转化前转化糖质量分数（％)=

F2f20.25100 －---－--－-－----－（7)

V1m

f2—费林氏液蔗糖校正值;

式中:F2——由测定乳糖时消耗样液的毫升数查表1所得转化糖数，mｇ;

ﻩV1—滴定消耗滤液量，mｌ

m—样品的质量，g。 4．3.2样液的转化及滴定

取50ml样液于10０ml容量瓶中，加水10ml，再加入10ｍｌ的盐酸（2．３），置75℃水浴锅中，时时摇动,在2min30s至2min45ｓ之间，使瓶内温度升至６7℃

后。自达到６7℃继续在水浴中保持5miｎ,于此时间内使其温度升至69．5℃,取出,用冷水冷却,当瓶内温度冷却至35℃时,加2滴酚酞溶液指示剂(2.４)，用氢氧化钠（２.５)中和至呈中性，冷却至20℃，用水稀释至刻度，摇匀。并在此温度下保温3０min后再按4.2.2滴定，得出滴定１０ｍl费林氏液的转化液量。

转化后转化糖质量分数（%）F3f20.50100－---－---－--－---－(8）

V2m式中:F３—由V２查表1所得转化糖数，mｇ；

f2—费林氏液蔗糖校正值；

ﻩV2—滴定消耗转化液量,ml

m—样品的质量，ｇ。 4.3.3蔗糖含量的计算

样品中蔗糖含量(ｇ/100g)=L1L20.95-----------（9） 式中：L1——转化后转化糖质量分数,%；

L2——转化前转化糖质量分数，％。 0．9５——蔗糖转化系数 ４.3.4如样品中

蔗糖与乳糖之比超过3：1时,则计算乳糖时应在滴定量中加入表2中的校正值后再查表1和计算。 4.３．５总糖=蔗糖＋乳糖 ５.允许差 5.1重复性

由同一分析人员在短时间间隔内测定的两个结果之间的差值,不应超过结果平均值的1．5％。 5．2重现性

由不同实验室的两个分析人员对同一样品测得的两个结果之差,不应超过结果平均值的2．5%。

表1 乳糖及转化糖因数表(10ｍl费林氏液)

滴定量,ml 乳糖，mｇ 转化糖,mg 滴定量,ml 乳糖,ｍｇ 转化糖，mg 1５ １6 17 １8 19 2０ ２1 ２2 2３ ２4 ２5 26 27 28 29 30 31 32 ６8.3 68.2 68.2 68.１ 68.1 68.０ 6８.0 68.0 ６7.9 67.9 67．9 ６7．9 6７.8 6７.８ 6７．8 67.8 ６7.8 67.８ 50.５ ５0.６ 50．7 50．8 50．8 50.9 51.0 51．０ 5１.1 51.2 51.2 51．3 5１.４ 51.4 51．５ 51.５ ５1.6 5１.6 3３ ３４ 35 ３6 37 ３8 39 ４０ 41 ４2 ４3 4４ 4５ 46 4７ 48 49 50 67．8 67.9 6７.９ 67.9 67．9 67.9 67.9 67.9 68.０ 68．0 68.０ 68.0 68．1 68.1 68.2 ６８.2 ６8．2 68.３ ５1．7 51.7 51．8 ５１.8 5１.9 51.9 52.0 ５２.0 52.1 5２.1 52.2 52．2 52.3 52.３ 52.４ 52．４ 52.5 ５2．5 注：“因数”系指与滴定量相对应的数目，可自表1中查得。若蔗糖含量与乳糖含量得比超过3:１时,则在滴定量中加表２中的校正数后计算。

表2乳糖滴定量校正值

滴定终点时所用的糖液量 ml １5 2０ 2５ 30 ３5 用10ml费林氏液、蔗糖及乳糖量的比 ３：1 0.15 0.2５ ０.3０ 0.35 0.40 6:１ 0．30 0．50 0．060 0.７０ 0.8０ ４0 ４5 5０

6． 注意事项

６.1甲乙液必须临用时混合。

0.45 0.50 ０.55 0．9０ 0.95 1.05 ６.2甲液中加入浓硫酸的作用是防止硫酸铜水解,同离子效应。

６．3整个滴定过程必须在沸腾状态下进行，目的是为了加快反应速度和防止空气进入,避免氧化亚铜和还原型的次甲基蓝被空气氧化从而使得耗糖量增加。 6．４ 测定中滴定速度、热源强度和煮沸时间等都对测定精密度有很大的影响。热源强度和煮沸时间一定要严格按照操作中的规定执行,且每个滴定的加热程度和煮沸时间必须一致，否则,加热到煮沸时间不同,蒸发量不同,反应液的碱度不同，从而影响反应的速度、反应进行的程度,最终影响测定结果。 6.5 平行实验中消耗样液差值应不超过0．1ml。

6.6 蔗糖在本方法规定的水解条件下,可以完全水解。而其他双糖和淀粉等的水解作用很小,可忽略不计。所以必须严格控制水解条件，以确保结果的准确性和重现性。此外果糖在酸性溶液中易分解,所以水解结束后应立即取出并迅速冷却中和。 6.7 ０.95的含义。

蔗糖水解为葡萄糖和果糖。蔗糖分子量３４2,而水解后２分子单糖的相对分子量为360。则342/3６０=０.95。即１ｇ转化糖相当于0.95g蔗糖。

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乳与乳制品常规理化指标检验

蛋白质含量的检测 YＬNB 2.8 一、凯氏定氮仪常量检测法 １. 原理

样品中加入催化剂和浓硫酸,经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水，而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵，硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定,根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。 2. 试剂

所有试剂,如未注明规格，均指分析纯；实验用水，如未注明其他要求,均指三级水。 2．１ 浓硫酸

2.２ 硫酸钾 2．3 硫酸铜

2.4 氢氧化钠溶液:4００g/L 2．５ 硼酸溶液：3０ｇ/L

２．6甲基红—溴甲酚绿混合指示剂:用体积分数为95%的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/Ｌ的乙醇溶液，使用时按１g／L溴甲酚绿:1g／L甲基红为５：1的比例混合。

2.7 硫酸标准溶液:c (H+)=０.10０0±0.005moｌ/L

2.7.１ 标准溶液的配制:取3mｌ浓硫酸加到15mｌ水中，冷却后洗入10００ｍｌ容量瓶中,定容。

2．7.2 标准溶液的标定:(见GＢ/Ｔ６０1－2０02）

２.7 3硫酸铵:干燥后最低含量99.９%，使用前直接将硫酸铵在102±２℃干燥至少2h,在干燥器中冷却至室温。 3. 仪器及器材

３.1 凯氏定氮仪，包括消化炉、废气排放装置、蒸馏单元及电位滴定仪 3.2 消化管，适用于凯氏定氮仪（3.1) ３．3 接收瓶:3０0mｌ三角瓶或烧杯 4. 方法 4．1 样品称取

4.1.1 原料奶和纯牛奶样品:称取约5g 4.1.2 乳饮料:称取约８ｇ ４．1.３ 冰淇淋:称取约５ｇ ４．１.４ 乳粉：称取约0．５g ４.2 测量 4.２.１ 消化

4.2.1.1将上述样品称入消化管中，同时称取5g硫酸钾，０.5g硫酸铜,然后加入１5-2０mｌ浓硫酸，将消化管放入消化炉中,将温度旋钮设定在大约6档左右,连接好排气装置并打开开关,开始进行消化,消化３0分钟或直到白烟消失后，将消化炉旋钮调节至９档，继续消化直到消化液透明。

4.2．1.2 消化至呈透明的蓝绿色后，继续消化至少1小时。在此过程中消化液必须沸腾。

注:决定一个精确的沸腾时间必须根据在一个特定的实验室用仪器测量一个特定 得样品所得到大量数据,一般选择一个高蛋白,高脂肪的牛奶样品,在透明后用不同的沸腾时间（1-1.5h）测定它的蛋白含量。蛋白平均含量随沸腾时间增加而增加,逐渐趋于恒定，然后当沸腾时间更长含量反而降低。选定能得到最大蛋白质的沸腾时间。

4.2.1.３ 消化结束后，消化液应是透明的。将消化管连同排气盖从消化器上移走，冷却到室温,冷却的消化液应是液体或在管底有少量的结晶体的液体。 注:大量的结晶体可能是消化过程中酸损失的结果，它能导致检测结果偏低。为 了减少酸的损失，可降低烟吸出的速度。

4.2.1．4 消化液冷却至室温后,移走排气盖,在每个管中慢慢加约2０ml水，摇动呈旋涡状使其充分混合,保证分离出的结晶体全部溶解，再冷却到室温。 4.２.2 蒸馏

把装有消化液的消化管放到蒸馏单元中,在冷凝器出口的下面放置一个接收瓶,还要把连接管放到接收瓶底端,编辑蒸馏程序，设定硼酸50ｍl,氢氧化钠65mｌ，蒸馏时间3—5min。

注：蒸馏时间是根据接收液的体积达到200ml而得到的。 ４．２.3 滴定

4.2．3.1 用pH为7．00和４.０0的缓冲溶液校准电位滴定仪。

4.2.3．2 设定电位滴定仪的滴定和结果计算程序，将滴定终点设为４.60,并开始滴定。

4.２.3.３ 记录结果。 4．３ 空白试验

按照4.2．1—4.2．３所写的步骤进行空白试验,在消化管中加入0．85g蔗糖,加入蔗糖的作用是使空白在消化过程中与样品消耗等量的硫酸。 ４.4 回收试验

4.4．1方法的准确性应定期通过下面的回收试验进行检查，按照4.１.1—４．１.３的步骤进行。

4.4.2用0.１2g硫酸铵加0.85g蔗糖进行测定。回收率应大于99%。

4．4.3用0．18g色氨酸或0.１6g盐酸赖氨酸（5.９)加0．67ｇ蔗糖进行测定。回收率应大于9８％。

4.4.4在以上的两个回收试验中（４.4．2和4.４.3）,低结果将说明过程失败和(或)硫酸标准溶液的浓度不准确。应检查凯氏定氮仪或重新标定硫酸标准溶液。 ５. 结果计算 5．１氮含量的计算

样品中氮含量(g/100ｇ）=其中：

V ——测定中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 V0—— 空白试验中消耗盐酸标准容液的体积，ml。 c (H+) ——硫酸标准溶液Ｈ+的摩尔浓度，mol/L。 m——样品质量,g。 四舍六入的结果保留到0.０1%。 ５．２蛋白质含量的计算

蛋白含量的计算，用质量百分数表达，用氮含量乘以6．３8即可。 5.３ 回收率的计算

用氮含量除以硫酸铵的理论氮含量２1．１9％即可。 6．允许差

同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5%。

二、半微量凯氏定氮法 １． 原理

样品中加入催化剂和浓硫酸，经加热后硫酸分解成亚硫酸酐、水和氧。有机物被氧化为二氧化碳和水,而蛋白质的氨态氮与过量的硫酸反应转变为硫酸铵,硫酸铵在碱性溶液中进行蒸馏。将蒸馏出来的氨用硼酸吸收，再用酸标准溶液滴定，根据酸标准溶液的用量和浓度计算出蛋白质含量。 2. 试剂

VV0CH0.014m100

2.1浓硫酸 2.2硫酸铜 2.3硫酸钾

2.4过氧化氢溶液：体积分数为3０%。

２.5硼酸溶液:３0ｇ/Ｌ。取30g硼酸，溶解在1Ｌ水中。

2.6甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：用体积分数为９5％的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g／L的乙醇溶液，使用时按1ｇ/L溴甲酚绿:1g／L甲基红为5:1的比例混合。

2.7硫酸标准溶液：ｃ(H＋)为0.1moｌ/L。配制与标定同常量凯氏定氮仪测定法。 ２．8氢氧化钠溶液,质量比为400/1000。称取400g氢氧化钠,用1000ｍL水溶解,待冷却后移入试剂瓶中。 ３. 仪器及器材

３.１凯氏烧瓶：500ml或250ml。 ３．２定氮蒸汽蒸馏器。 ３.3滴定管:25ml。 3.4三角烧瓶:２50ml。 ４. 方法

4．1 精密称取奶粉样品2ｇ或1０~20g液体样品(约相当于氮３0～40ｍg)，将样品放入凯氏烧瓶（3.１)中，加入10g硫酸钾（2.3）和1ｇ硫酸铜（2.2)，量取２0mｌ浓硫酸（３.1），徐徐加入凯氏烧瓶中，混合。 注：１．加入样品及试剂时,避免粘附在瓶颈上。

２．加入硫酸钾的作用：提高硫酸的沸点(338℃),增进反应速度。１0g硫酸钾将沸点提高到4０0℃,但过多的硫酸钾会造成沸点太高，生成的硫酸氢铵在51３℃会分解。

３．加入硫酸铜的作用:作催化剂,使氧化作用加速。

４.２凯氏烧瓶的瓶口放一小漏斗，用微火加热(小心瓶内泡沫冲出而影响结果），当瓶内发泡停止,稍加大火力。同时，可分数次加入1０ml过氧化氢溶液(2.4)(但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入）。当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时继续消化０.5~1h（如凯氏烧瓶壁粘有炭化粒时,进行摇动或待瓶中的内容物冷

却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下,继续消化至呈透明为止)。然后取下并使之冷却。

4.3将澄清的消化液小心移入10０mｌ容量瓶中,以水洗三次凯氏烧瓶,洗涤液并入上述容量瓶中,冷却后稀释至刻度并摇匀。

4.4吸取２5ml消化液与定氮蒸馏器中，在冷凝器的下端放置一个盛有50ml硼酸溶液（2．5）、３滴甲基红—溴甲酚绿混合指示剂（2.6）的250ｍl锥形瓶,冷凝器下端的玻璃管在液面以下。将25mｌ氢氧化钠溶液慢慢地加入蒸馏瓶中(溶液应呈强碱性)，迅速将塞子塞好,然后通入蒸汽进行蒸馏，蒸至液面达１5０ml时,提出冷凝管靠在锥形瓶的瓶壁,出液口在20０ml刻度线以上,继续蒸馏,蒸至液面达20０ml。

注:１．蒸馏时可视蒸馏器大小,同时减少消化液和氢氧化钠的体积数,保证溶液应呈强碱性。

2．蒸馏时要注意蒸馏情况,避免瓶中的液体发泡冲出，进入接收瓶。火力太弱,蒸馏瓶内压力减低,则接收瓶内液体会倒吸,造成实验失败。

4．5用硫酸标准溶液(2.7)滴定至溶液出现酒红色为止,记录所用硫酸标准溶液的体积。同时进行空白试验，并在结果中加以校正。 5. 结果计算

样品中蛋白质含量(g／１00ｇ)＝

VV0CH0.014F25m100100

式中:v—滴定时消耗硫酸标准溶液的体积，ｍl;

v0—空白试验消耗硫酸标准溶液的体积，ml; ｃ（H+)—硫酸标准溶液中H+的浓度，mol/l; m—样品的质量，g;

0．014—氮原子的摩尔质量，kg/ｍol;

F—氮换算为蛋白质的系数。乳粉为6.３8，纯谷物类（配方）食品为5.90,含乳婴幼儿谷物(配方)食品为6．2５。

注：空白试验仅不加入样品，操作步骤与样品相同。 6. 允许差

同一样品的两次测定值之差不得超过平均值的1.5%。

7. 注意事项

7.1 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。

7.２ 样品中脂肪或糖含量较高时，消化过程中易产生大量的泡沫,可加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂,并同时注意控制热源强度。

7.3有机物完全分解,消化液呈兰色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 7.4蒸馏装置不能漏气。

7.5 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈兰色,不生成氢氧化铜沉淀。此时需要再增加氢氧化钠的用量。

7.6硼酸吸收液的温度不能超过40℃,否则对氨的吸收作用减弱而造成损失。 7.7 混合指示剂临用时混合，它在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色,酸性溶液中呈红色。因用硫酸滴定硼酸铵溶液,生成硫酸铵应为强酸弱碱盐,所以溶液呈酸性,指示剂应显红色。

7．８蛋白测定中，在催化剂中加入二氧化钛，消化速度将会更快。能使难以氨化的组分快速氨化。蒸馏时可加入锌粒,其作用相当于沸石,用量如绿豆大即可。

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乳与乳制品常规理化指标检验

乳粉不溶度指数的检测 YLNＢ 2．９

1. 定义

不溶度指数：在本标准规定的条件下，将乳粉或乳粉制品复原,并进行离心,所得到沉淀物体积的毫升数。 2. 原理

将样品加入到２4℃或5０℃的水中,然后用特殊的搅拌器使之复原,静置一段时间后(有规定）， 使一定体积的复原乳在刻度离心管中离心，去除上层液体,加入与复原温度相同的水,使沉淀物重新悬浮,再次离心后,记录所得沉淀物的体积。

注：喷雾干燥产品复原时使用温度为2４℃的水,部分滚筒干燥产品复原时使用温度为50℃的水。

3. 试剂

所有试剂，如未注明规格,均指分析纯；实验用水,如未注明其他要求,均指三级水。

硅酮消泡剂:硅酮乳化液的质量分数为30%。 4. 仪器及器材

4.1水浴锅:工作温度为２4．0±0.２℃或50．0±0.2℃，可放置一个或几个搅拌杯（４．8)

4.2温度计:可测定温度为24℃或５0℃,误差不超过±0.２℃。

注:由于复原温度是影响不溶度指数的重要因素,所以在5.1和５.3(和5.4.8）中所用温度计的准确度应符合规定。

4.3表面光滑的勺,或干净且光滑的取样纸（尺寸为1４０mm×140ｍm）。用来称样。 4.4天平:准确至0.0１g。

４．5塑料量筒：容量为100mL±０.5ｍl(2０℃)。

注：与玻璃量筒相比,塑料量筒热容较低,所以在量筒中加入水后,温度变化最小。 4.6刷子:可刷去勺或称样纸(4.3）上的残留样品。 4.７电动搅拌器,具有以下特性:

a.搅拌器轴上有16个叶片（不锈钢）,。叶片平的一面位于下方，对于安顺时针方向旋转的搅拌器，叶片从右向左向上倾斜。

ｂ.叶片之间成3０o角，水平齿间距（叶轮的圆周)为８.73ｍm(11/32英寸），使用一段时间后这些尺寸可能会有变化，因此应周期性的检查和维护。

c.当搅拌杯固定在搅拌器上后，搅拌器轴的高度(即从叶片最低处到杯底的距离）应为10ｍm±2mｍ,也就是说杯的深度为１3２ｍm,由杯的顶部到叶片最低处是122mm±2mm,杯顶部到叶片最高处为115±2mm。叶轮应位于杯中央。

ｄ.搅拌杯中加入100ml２４℃的水［加入或未加入样品(5．2）]进行混合时，搅拌器接通后,叶轮的固定转速为３６0０±10０r/min(在5ｓ之内达到）。叶轮的旋转方向应为顺时针。应使用电动测速仪定期检查,在负载情况下叶轮的转速(如上所述),这对旧型的搅拌器尤其重要。对于非同步电动机，转速可以用调速器或速度指示器调整到36０0±100 r／ｍin（适用于转速的准确度得不到保证的搅拌器）。

4.8 玻璃搅拌杯:容量为500ml。可与搅拌器（4.7)配套使用。 ４.9 计时器:可显示0-60s和0-６0miｎ。 ４.１0 平勺：长度约为21０mｍ。

４．11 电动离心机：有速度显示器，垂直负载,有适合于离心管（4．12）并可向外转动的套管,管底加速度为160gｎ,并且在离心机盖合时,温度保持在２0－25℃。

注:在离心过程中产生的加速度等于1．1２ r n2×106;r为水平旋转的有效半径, mm;ｎ为转速,ｒ/min。

4．1２玻璃离心管,锥形，带橡胶塞。刻度数和标注“ml(20℃)”应持久不退，刻度线应清晰干净。2０℃时,其容量最大误差如下： ——在0.１ml处:±0.05ml; ——在０.1-1ml:±０.１mｌ； ——在1-2ml:±0.2ml; ——在2－5mｌ：±0．3ｍｌ； ——在5-１0ml:±0.５ml； ——在１0ｍl处：±１ｍl。

注:作为日常生产控制，可以使用其他形状的离心管,但容量误差必须符合上面所列的要求。如果是有争议的或需要确定的结果,则应使用4.１2中规定的离心管。 4.1３ 虹吸管或与水泵相连的吸管:可除去离心管（4．12)中的上层液体,管由玻璃制成，并且带朝上的U型管，适于虹吸。

４.１４ 玻璃搅拌棒：长２５0mｍ,直径为3.５mm。 4.１5 放大镜:读取沉淀物体积数。 5. 方法 ５.1样品的制备

测定前，应保证实验室样品至少在室温（20-２5℃)下保持４8h,以便使影响不溶度指数的因素,在各个样品中趋于一致。

然后反复振荡和反转样品容器，混合实验室样品。如果容器太满,则将全部样品移入清洁、干燥、密闭,不透明的大容器中,如上述彻底混合。

对于速溶乳粉，应小心地混合，以防样品颗粒减小。

５.2 搅拌杯的准备

根据不溶度指数的测定温度(２4℃或5０℃)，分别将搅拌杯(4.8）的温度调整到24.０±0.２℃或50.0±０.2℃。方法是将搅拌杯放入水浴（4.1）中一段时间,水位接近杯顶。

注:后文中，“在24.0±0.2℃或50.0±0.２℃是适当的”是指采用这一温度。 5．3样品部分

用勺(4.3）或在称样纸（４．3）上称样，精确至0.０1ｇ，取样量如下： a) 全脂奶粉、部分脱脂奶粉、全脂加糖乳粉、乳基婴儿食品及其他以全脂乳粉和部分脱脂奶粉为原料生产的乳粉产品:1３.00g； b) 脱脂乳粉和酪乳粉：10.０0g c) 乳清粉:7．00g 5.4 测定

5．4.1 从水浴中取出搅拌杯（见５.2）,迅速擦干杯外部的水，用量筒（4.5）向杯中加入10０ml±0.５ml、2４.0±0.2℃或5０.0±0．2℃的水（见5.2注） ５．４．２ 向搅拌杯中加入３滴硅酮消泡剂(3.１)，然后加入样品(5.3）,必要时，可使用刷子（4.6)，以便使全部样品均落入水表面。

5.４.3 将搅拌杯放到搅拌器（４.7）固定好，接通搅拌器开关，混合90s后，断开开关。如果搅拌器为非同步电动机，带有调速器或速度指示器，则将叶轮在最初5s内的转速调到3６００ｒ／min±10０r/ｍin，并混合９0s。

５.4.4 从搅拌器上取下搅拌杯（停留几秒，使叶片上的液体流入杯中）,将杯在室温下(见8.2）静置５miｎ以上,但不超过１5miｎ(见８.3）。

５.4.5 向杯内的混合物（见8.５）加入3滴硅酮消泡剂,用平勺(4.１0）彻底混合杯中内容物10s(不要过度）,然后立即将混合物倒入离心管（5.１2）中至50ml刻度处,即顶部液位与５0ml刻度线相吻合。

5.4.6 将离心管放入离心机中（要对称放置）,使离心机迅速旋转,并在管底部产生１6０g n的加速度,然后在20-25℃下使之旋转5min。

5.４．７ 取出离心管,用平勺(４.10)去除和倾倒掉管内上层脂肪类物质。竖直握住离心管,用虹吸管或吸管（4.13)去除上层液体，若为滚筒干燥产品,则吸到顶部液位与1５ｍl刻度处重合,若为喷雾干燥乳粉，则与10ml刻度处重合，注意不

要搅动不溶物。如果沉淀物体积明显超过１5ml或１0ｍl，则不再进行下步操作，记录不溶度指数为“１5ml”或“＞１０ml”，并标明复原温度。反之应按5.4.8所述操作。

5.4.8 向离心管中加入２4℃或50℃的水(见５．2注),直到液位与３０ｍｌ刻度重合，用搅拌棒（4．１4)充分搅拌沉淀物，将搅拌棒底靠管壁,加入相同温度的水,将搅拌棒上的液体冲下，直到液位与50ml刻度处重合。

5.4．9 用橡胶塞塞上离心管，缓慢翻转离心管5次,彻底混合内容物，打开塞子(将塞底部靠在离心管边缘，以收集附着在上面的液体),然后如5.4.6所述，在规定的转速和温度下离心5mｉｎ。

注：建议将离心管放入离心机中时，使离心管的刻度线在离心机旋转时即不朝上也不朝下,而是处于中间位置。这样即使沉淀物顶部倾斜,沉淀物体积也很容易估算。

5．４.10 取出离心管，竖直握住离心管，以适当背景为对照,使眼睛与沉淀物顶部平齐,借助放大镜(4.1５）读取沉淀物体积数。如果沉淀物体积小于0．５ｍl,则精确至０．05mｌ。如果沉淀物体积大于0.5ml,则精确至０.1ml。如果沉淀物顶部倾斜,则估算体积数。如果沉淀物顶部不齐,则使离心管垂直放置几分钟。通常沉淀物的顶部会变平些,因此比较容易读数。记录复原水温度。 6. 结果计算

样品的不溶度指数等于5.4.1０中所记录的沉淀物体积的毫升数。并报告复原时所用水的温度。例如：0.1ｍl(２4℃)； ４.1ml(50℃） 7.允许差 ７.１ 重复性

由同一分析人员,用相同仪器,在短时间间隔内，对同一样品所做的两次单独实验的结果之差不得超过0．１3８M，M是两次测定结果的平均值。 ７.2 重现性

由不同实验室的两个分析人员，对同一样品所做的两次单独试验结果之差不得超过0．32８M,M为两次测定结果的平均值。 8. 注意事项

8．1 实验一旦开始，就应连续进行。任何步骤都不得间断。必须严格遵守所有关

于温度和时间的规定。

8.2 由于不溶度指数的测定可能受环境温度的影响,所以建议检验过程应在２0－25℃的实验室内进行。

8．3 该检验中允许有5-１5mｉｎ的放置时间（６.4.４),这点已表明对不溶度指数无明显影响。在10min之内如果事先将几个搅拌杯的温度都已调好（见6.2)，且将样品(６．3)同时称好，则可将这几个样品作为一批同时测定。这样,可以发现修正后的6．2和6.4.1操作步骤有一定的优越性,即向放在水浴中的搅拌杯内加入１００ｍｌ±０.5ｍl水(温度适当）。当杯内水温稳定在正确值后,由水浴中取出一个搅拌杯,然后再按6.４.1－6.4．4步骤操作，同样,依次准备其他搅拌杯，这样则可同时离心成批样品。

8.４ 各试样量等于:混合时,100ｍl水中样品的总固形物含量(用混合物的质量分数表示)大约为原始液体中的总固体含量。

8.５ 在6．４．5中加入３滴硅酮消泡剂(４．１）,对在混合过程中不大可能起泡的产品则是不必要的。但是为了使所有样品的操作步骤一致,应均加入3滴消泡剂。

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乳与乳制品常规理化指标检验

乳与乳粉杂质度的检测 YLNＢ ２.

10

1． 定义

杂质度：根据本方法测得的5０0ｍl液体乳样品或6２.５g乳粉样品中,不溶于约６0℃热水残留于过滤板上的可见带色杂质的数量。 2. 仪器及器材

2.1 过滤设备:正压或负压杂质度过滤机或２000-250０mｌ抽滤瓶（配有可安放棉质过滤板的瓷质过滤漏斗或特制漏斗)。

２．2 棉质过滤板:直径32mm,密度为１35g/m３,过滤时牛乳通过面积的直径为28.6mm。

2.3 烧杯:500ｍl。 3. 方法

3．１ 取液体奶样5０0ml,加热至60℃(乳粉样称取６２．5g，用已过滤的水充分调和，加热至６0℃或直接用60℃水充分调和)。于过滤装置上的棉质过滤板上过滤,用水冲洗附于过滤板上的牛乳。将过滤板置于烘箱中烘干后，在非直接但均匀的光亮处与杂质度标准板比较，即可得出过滤板上的杂质量。

当过滤板上杂质的含量介于两个级别之间时，判定为杂质含量较多的级别。 4． 分析结果的表述

与杂质度标准板比较得出的过滤板上的杂质量,即为该样品的杂质度。 5. 允许差

按本标准所述方法对同一样品所做的两次重复测定，其结果应一致,否则应重复再测定两次。

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乳与乳制品常规理化指标检验

硝酸盐、亚硝酸盐的检测 YLNB 2.1１ 1. 范围

本方法规定了采用镉还原和光度分析法测定硝酸盐和亚硝酸盐的方法。 本方法适用于乳粉、液体奶、乳清粉及婴儿配方粉中硝酸盐和亚硝酸盐的测定。

本方法的检出极限分别为：硝酸盐1．5mｇ/kg;亚硝酸盐0.2mg/kg。 2. 原理

将样品溶解于水中,沉淀脂肪和蛋白后,进行过滤。用镀铜镉粒使部分滤液中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。在未还原的滤液和已还原的滤液中，加入磺胺和N-1

萘基-乙二胺二盐酸盐,使其显粉红色,然后用分光光度计在538nm波长下测其吸光度。

将测得的吸光度与亚硝酸钠标准系列溶液的吸光度进行比较，就可计算出样品中的亚硝酸盐含量和硝酸盐还原后的亚硝酸盐总量，从两者之间的差值可以计算出硝酸盐的含量。 3. 试剂

测定用水应是不含硝酸盐和亚硝酸盐的蒸馏水或去离子水。

注：为避免镀铜镉粒(4.10）中混入小气泡,柱制备（5.1）、柱还原能力的检查（5.2）和柱的再生(5.3）时所用的蒸馏水或去离子水,最好是刚煮沸过并冷却至室温的。 3.1 镀铜镉粒：直径0.３-0.8mm。也可下述方法制备。

将适量的锌棒放入烧杯中，用4０g/Ｌ的硫酸镉(CdSO4 8H２O）溶液浸没锌棒。在24ｈ之内，不断将锌棒的海绵状镉刮下来。取出锌棒,滗出烧杯中多余的溶液,剩下的溶液能浸没镉即可。用蒸馏水冲洗海绵状镉2-3次，然后把镉移入小型搅拌器中,同时加入４０0ml 0.1ｍol/L的盐酸搅拌几秒钟，以得到所需粒度的颗粒。将搅拌器中的镉粒连同溶液一起倒回烧杯中，静置几小时，这期间要搅拌几次以除掉气泡。倾出大部分溶液,立即按5．１.１至5.1.８中叙述的方法镀铜。 3.2 硫酸铜溶液：溶解2０g五水硫酸铜（ＣuSO4 ５H2Ｏ)于水中,稀释至1000ｍｌ。

3．3 盐酸-氨水缓冲溶液:pＨ９.60-9.70。用6００ｍl水稀释７5ｍl浓盐酸［ρ

2０

1.19g/mL，质量分数约为38%]。混匀后。再加入1３5ml浓氨水[ρ200.９1ｇ／

mL，质量分数等于25%的新鲜的氨水］。用水稀释至1000ml,混匀。用精密的ｐH计调PH值为9．60-9.７０。

３.４ 盐酸溶液：c(H＋)约为２ｍol/Ｌ。用水将160ml的浓盐酸(ρ201.98g/mL)稀释到1000ml。

3．5 盐酸溶液：c(H＋）约为０.1ｍoｌ/Ｌ。将50ｍl的2moｌ/L盐酸溶液用水稀释到１000ｍl。

３.6 沉淀蛋白和脂肪的溶液：

3．６．１ 硫酸锌溶液：将53．５g的七水硫酸锌（ZnＳＯ4 7Ｈ2O)溶于水中,并稀释至１0０ml。

3．６．2 亚铁氰化钾溶液：将1７．２g的三水亚铁氰化钾[K２Fｅ（CN)6 3H2O］溶于水中，并稀释至10０ｍｌ。

3.7 EDTA溶液:用水将3３．5ｇ的二水乙二胺四乙酸二钠（Ｎa２Ｃ10H1４N２O３ 2H２Ｏ)溶解,稀释至１0００ml。

3.８ 显色液１：体积比４50：５50盐酸溶液。将４50ml浓盐酸加入到55０ml水中,冷却后装入试剂瓶中。

3.9 显色液２：5ｇ/L的磺胺溶液。在75ml的水中加入5ml浓盐酸,然后在水浴上加热,用其溶解0.５g磺胺（NH２C6H4SＯ2NH2)。冷却到室温后用水稀释到100ml。必要时进行过滤。

３.10 显色液3:1g/L的萘胺盐酸盐溶液。溶解０.1g的Ｎ－１-萘基-乙二胺二盐酸盐于水中,用水稀释到1０0mｌ。如有必要过滤。

注:此溶液应少量配制,装于密闭的棕色瓶中，冰箱中2～5℃保存。 3．11 亚硝酸钠标准溶液：相当于亚硝酸盐的浓度为0.００1g/Ｌ。

将亚硝酸钠（NaNO２)在110℃－１2０℃的范围内干燥至恒重。冷却后称取０.1５0g,溶于1０00mｌ的容量瓶中,用水定容。在使用的当天配制该溶液。

于1000ml的容量瓶中，吸取10ml上述溶液和20ｍl缓冲溶液（3.3），用水定容。

１毫升此标准溶液含1.00µg的NO2-。

3.1２ 硝酸钾标准溶液,相当于硝酸盐的浓度为０.0045 g/L。

将硝酸钾（ＫNＯ3）在11０℃-120℃的范围内干燥至恒重。冷却后称取1.4６８０ｇ,溶于10００ml的容量瓶中，用水定容。

在使用当天,与1０00mL的容量瓶中,取5ml上述溶液和20mｌ缓冲溶液（3.3）,用水定容。

１mＬ的该标准溶液含有4.50µg的NＯ3。 4. 仪器及器材

所有玻璃仪要用蒸馏水冲洗,以保证不带有硝酸盐和亚硝酸盐。 4.1 分析天平。 ４.2 烧杯:1００mｌ。

4．3 锥形瓶：25０ml，５0０mｌ。

-

4.4 容量瓶:体积为１０0ｍｌ,500ｍl,1000mｌ。 4.5 移液管：2ｍｌ，５ml,10ｍｌ，2０ml。 4.6 吸量管:2ml，5ml，10ml,２５ml。 ４．7 量筒:根据需要选取。

4．8 玻璃漏斗:直径约为９cm，短颈。 ４.9 定性滤纸：直径约１8ｃm。 4.１０ 还原反应柱：简称镉柱。

４.1１ 分光光度计：测定波长为５38nm,使用1-2cm光程的比色皿。

4.1２ pＨ计，精度为±0.０1，使用前用pH7和ｐH9的标准溶液进行校准。 5． 方法

5.1 制备镀铜镉柱

5.1．１ 置镉粒（３．1）于锥形烧瓶(４.3）中(所用镉粒的量以达到要求的镉柱高度为准）。

5．１.2 加足量的盐酸（３.4）以浸没镉粒,摇晃几分钟。

５．１．３ 滗出溶液,在锥形烧瓶中用水反复冲洗,直到把氯化物全部冲洗掉。 5．1.4 在镉粒上镀铜。向镉粒中加入硫酸铜溶液（3.２)(每克镉粒约需２．５mｌ），摇晃1min。

5.1.5 滗出溶液,立即用水冲洗镀铜镉粒,注意镉粒要始终用水浸没。当冲洗水中不再有铜沉淀时即可停止冲洗。

5.1.6 在用于盛装镀铜镉粒的玻璃柱的底部装上几厘米高的玻璃纤维。在玻璃柱中装入水，排净气泡。

5.1．7 将镀铜镉粒尽快地装入玻璃柱,使其暴露于空气的时间尽量短。镀铜镉粒的高度应在15-20cm的范围内。

注:１ 避免在颗粒之间遗留空气。

2 注意不能让液面低于镀铜镉粒的顶部。

５.1.8 新制备柱的处理。以不大于６ml/min的流量将由750ｍl水、225ml硝酸钾标准溶液（３.１2)、2０ml缓冲溶液(3.3）和2０mlEDＴＡ溶液（３.７)组成的混合溶液通过刚装好镉粒的玻璃柱，接着用50ｍl水以同样的流速冲洗该柱。 ５.２ 检查柱的还原能力

这种检查每天至少要进行两次,一般在开始时和一系列测定之后。 5.２.1 用移液管将20ml的硝酸钾标准溶液(3.12)移入还原柱顶部的贮液杯中，再立即向该贮液杯中添加5mｌ缓冲溶液(3.3)。用一个１00ml的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不应超过6ml/ｍiｎ。

5．2.２ 在贮液杯将要排空时，用约１5mL水冲洗杯壁。冲洗水流完后，再用15ml水重复冲洗。当第二次冲洗水也流完后,将贮液杯灌满水，并使水以最大流量流过柱子。

５．2.3 当容量瓶中的洗提液接近１00ml时,从柱子下取出容量瓶,用水定容至刻度，混合均匀。

5.２．4 移取１0ml洗提液于100ml容量瓶中,加水至60ｍl左右。然后按５.8.２、５．８.3、5.８.4操作。

５.２.5根据测得的吸光度，通过回归方程（5.8．５）计算出稀释洗提液(5．2.4)中的亚硝酸盐含量(µg／mL)。据此可计算出以百分率表示的柱还原能力（ＮＯ2-的含量为0．0６７µg/mL时还原能力为1０0%）。如果还原能力小于9５％或大于10５％,柱子就需要再生。 5.3 柱子再生

柱子使用后，及镉柱的还原能力低于９５%或高于１05％时，按如下步骤进行再生。

5．3.1 在10０mｌ水中加入约5mｌＥDＴA溶液（3.7)和2ｍl盐酸溶液(3.５)。以10ml/ｍin左右的速度过柱。

5.3.２ 当贮液杯中混合液排空后,按顺序用25ml水、25ｍｌ盐酸(３．5）和25mｌ水冲洗柱子。

５.３.3 检查柱子的还原能力,如低于95％或高于105％,要重复再生。 5.４ 样品的称取和溶解

５.4.1 液体乳样品：量取90ml样品于５００ｍl锥形瓶中,用２２ml５0-5５℃的水分数次冲洗样品量筒，冲洗液倾入锥形瓶中，混匀。

５.４.２ 乳粉样品：在1０0ml烧杯中称取１0ｇ样品，准确至0.001g。用112ml50-55℃的水将样品洗入５00mｌ锥形瓶中,混匀。

5.4.3 乳清粉及乳清粉为原料生产的婴儿配方粉样品：在1００ml烧杯中称取１

0g样品，准确至0.00１ｇ。用1１2ｍl50-5５℃的水将样品洗入500ml锥形瓶中,混匀。

用铝箔纸盖好锥形瓶瓶口，将溶好的样品在沸水中煮15mｉn然后冷却至约５0℃。 ５.5 脂肪和蛋白的去除

５．5.1 按顺序加入24ml硫酸锌溶液(３.6.1）、２４ｍｌ亚铁氰化钾溶液(3.６.2)和4０ml缓冲溶液(5．3），加入时要边加边摇，每加完一种溶液都要充分摇匀。 5.５.2 静置１5min－1ｈ。然后用滤纸(4.9）过滤,滤液用2５0ml锥形瓶收集。 5.６ 硝酸盐还原为亚硝酸盐

5.6.１ 移取20ml滤液于100mｌ小烧杯中，加入5mｌ缓冲溶液（3．３)混匀,倒入镉柱顶部的贮液杯中，以小于6ml/ｍin的流速过柱。洗提液（过柱后的液体)接入1００mｌ容量瓶中。

５．6．２ 当贮液杯快要排空时，用15ｍｌ水冲洗小烧杯,再倒入贮液杯中。冲洗水流完后,再用１5ｍl水重复一次。当第二次冲洗水快流完时，将贮液杯装满水，以最大流速过柱。

5.６．３ 当容量瓶中的洗提液接近１00ml时,取出容量瓶，用水定容,混匀。 5．7 测定

5．7.１ 分别移取20ｍl洗提液（５.6.３）和20ml滤液（5.5.2）于100ml容量瓶中，加水至约60ml。

5.7.2 在每个容量瓶中先加入6mｌ显色液１(3.8）,边加边摇;再加入5ml显色液2（3．９)小心混合溶液，使其在室温下静置5miｎ，避免阳光直射。

5．7.3 加入2ml显色液３(3.１0)，小心混合,使其在室温下静置５min，避免阳光直射。用水定容至刻度，混匀。

５.7.4 在15min内用５３8nｍ波长,以空白试验溶液为对照测定上述样品溶液的吸光度。

5．８ 标准曲线的制作

5.8.1 分别移取(或用滴定管放出)0,2，4,6，8，1０,1２,1６，2０ml亚硝酸钠标准溶液（３．11)于九个1０0ml容量瓶中。在每个容量瓶中加水,使其体积约为60ml。

5.8.２ 在每个容量瓶中先加入６ml显色液1（3.8）,边加边混;再加入5ml显色

液2（３．9)。小心混合溶液,使其在室温下静置5ｍin,避免阳光直射。 ５.8.3 加入2ml显色液3(３．1０），小心混合，使其在室温下静置5min,避免阳光直射。用水定容至刻度，混匀。

５.8.4 在15min内,用５３8nm波长,以第一个溶液(不含亚硝酸钠）为对照测定另外八个溶液的吸光度。

5.８.5将测得的吸光度和亚硝酸根质量浓度两组数据分别输入exｃel表，通过excel表计算出回归方程。亚硝酸根的质量浓度可根据加入的亚硝酸钠标准溶液的量计算出。亚硝酸根的质量浓度以µg/ml表示。（亚硝酸根的质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标。) ６． 结果计算 ６.1 亚硝酸盐的含量

样品中亚硝酸根含量（mg/ｋg）=

20000C1 ---－------ -－--－- (1)

mV1式中:ｃ1—根据滤液(5.5.2）的吸光度（5．7.4），通过回归方程计算出的NO2-的浓度,µg/ml;

m—样品的质量,g;

V1—所取滤液（５.5.2)的体积（5.7.１)。 样品中以亚硝酸钠表示的亚硝酸盐含量

W（NａNO2）=1.5×Ｗ(NO2-）-－--－-－------－---(2)

式中：W（NO2-)—样品中亚硝酸根的含量，ｍg/kg；

W(NaNO2)—样品中以亚硝酸钠表示的亚硝酸盐的含量，mｇ／kg。 报告测定结果准确至0.１mｇ/kg。

６.２ 硝酸盐含量

100000C2WNO2-------- 样品中硝酸根含量(ｍg/kｇ）= 1.35mV2式中:c2—根据洗提液（5.6．3)的吸光度（5．7.４),通过回归方程计算出的亚硝

酸根离子的浓度，µg/ml；

ｍ—样品的质量,g;

Ｖ２—所取洗提液(5.５.２）的体积（５.7.1）。 W（NＯ2-)—根据式（1)计算出的亚硝酸根含量。 若考虑柱的还原能力,

100000C2WNO2100 样品中硝酸根含量(mg/kｇ)＝1.35mV2rﻩ

式中：r —测定一系列样品后的还原能力 样品中以硝酸钠表示的硝酸盐含量

W（NaNＯ３）=1.371WNO3---------－-----------－--－－－--(５)

式中：W(ＮO3－）—样品中硝酸根的含量,mg/ｋｇ;

W(NaNO３）—样品中以硝酸钠计的硝酸盐的含量,ｍｇ/kg。 报告测定结果准确至0．1ｍg/ｋg。 7. 允许差 7．1 重复性

７．1.１由同一分析人员在短时间间隔内测定的两个亚硝酸盐结果之间的差值，不应超过1mg／kｇ。

７．1.2 由同一分析人员在短时间间隔内测定的两个硝酸盐结果之间的差值,在硝酸盐含量小于30mg／ｋg时，不应超过3mｇ/kg；在硝酸盐含量大于30mｇ／kg时，不应超过结果平均值的10%。 ７.2 重现性

由不同实验室的两个分析人员对同一样品测得的两个硝酸盐结果之差，在硝酸盐含量小于３0ｍg／kg时,差值不应超过8mg/kg；在硝酸盐含量大于或等于30mｇ／ｋg时，该差值不应超过结果平均值的25％。 8. 注意事项

8.1 镉是有害元素,在处理镉粒时，不要用手直接接触，同时注意不要弄到皮肤上,一旦接触立即用水冲洗。

8.2实验用水必须不含有亚硝酸根和硝酸根。

8.3氨缓冲液除控制溶液的pH外，还可缓解镉对亚硝酸根的还原。

8.4对于颜色较深的样品,在处理时,应加脱色剂进行脱色处理,以防止由于样品本身的颜色干扰影响检测结果．

8.5为了检查实验的准确性,要定期进行回收率测定

步骤:做样品的同时，另外取相同的样品进行实验，只在加入沉淀剂之前用移液管吸取5ml硝酸钾溶液（必须准确,且加水量减少5mｌ),以下步骤同样品硝酸盐测定。

计算：计算出加了硝酸钾的样品的硝酸盐，减去样品本身所含的硝酸盐，即为加了硝酸钾后样品硝酸盐的实际增加量。然后计算出硝酸盐理论增加量：公式如下：

CNO3 理论增加量（以硝酸钠计）= 51.371

m其中:

C(NＯ－3)——所吸取的硝酸钾的浓度，一般为45μｇ m——样品质量，g

５——吸取硝酸钾的毫升数，ｍｌ 1.37１——硝酸钠和硝酸根的换算系数

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乳与乳制品常规理化指标检验

乳铁蛋白铁饱和度的检测 ＹLＮB ２.1２ 1. 原理

1０0%饱和的１0mg／ml乳铁蛋白溶液在４6５nm处的吸收值为0.48。基于此,可估计未知溶液的Fe３+饱和度。必须对溶液进行稀释,使其在A2８０测量时的测

量值在1.0０和１.5０之间。在进行Ａ４65和A2８０处测量前必须用0．45μｍ的醋酸纤维素膜过滤溶液。 2． 仪器及器材

2.1 精确到０.00１g的天平; 2.2 1 L的容量瓶； 2.3 ２５ ｍl的容量瓶； 2.４ １0 ｍl的容量瓶; ２.５ 50 ｍl的玻璃烧杯; ２.6 磁力搅拌器和搅拌棒； 2．７ 0.４5μm 的醋酸纤维素膜; 2.8 分光光度计。 3． 试剂

3．１ ＮaCl (优级纯或基准试剂， MＷ58.4４); 3．2 超纯水。 4. 方法

4.1 0.15 mol／L 氯化钠（NａCｌ)

称量8．７67ｇ ＮａＣl，放入烧杯中用850 ml Millｉ Q水溶解。移到1 Ｌ的容量瓶,用Mｉｌli Q水配成1升，倒置混匀。 ４.2 样品准备

称量250 mg乳铁蛋白样品放入50 ml的玻璃烧杯中。加入约20 ml 0．15 mｏl／Ｌ的NaCl和磁力搅拌棒。放在磁力搅拌器上混合直至溶解。转移到25 ml的容量瓶中,用０.15M的ＮaCl清洗烧杯,然后用同样的NaCｌ溶液进行标定。盖上瓶塞，倒置混匀。得到10 mｇ/ｍl的乳铁蛋白溶液。

上述１ mｌ 10 mg/ml的溶液在容量瓶中用０．15M的NaＣl稀释至10 ｍl。盖上瓶塞,倒置混匀。得到１ mg/mｌ的乳铁蛋白溶液。

乳铁蛋白溶液和2０ ml 0．15 ｍol/L的NaＣl溶液都用0.45μｍ的醋酸纤维素膜过滤。 ５. 测量

５.1 打开分光光度计,预热30分钟。

５.2 波长设定在4６5 nｍ，用过滤后的0.15 M NaCl调零。 5．3 测定1０ ｍｇ/ml的乳铁蛋白溶液在465 nm处的吸光度值。 5.4 记下吸收值。

5.5 再把波长设定在２8０ ｎm,用过滤过的０.15 M NａCｌ重新调零。 ５.6 在280 nｍ处测定１ mg／ml乳铁蛋白溶液的吸光度值。 5.７ 记录测定数值。

5.8 用Milｌi Q制备的纯水清洗分光光度计，然后关机。 7． 结果计算

用下面的公式计算１ ｍg/mｌ乳铁蛋白溶液中蛋白质的浓度： [蛋白质］=Ａ280nｍ / 1.3（精确到小数点后两位）

用下面的公式计算１0mg/ｍl溶液中Fe饱和度:

Fe３＋饱和度百分比＝ Ａ465 /([蛋白质] ×０.48）×1００（结果精确到小数点后两位)。

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乳与乳制品微生物检验

菌落总数的检测 YL

ＮB 3.1

方法一：

1． 引用依据：ＧB/Ｔ４789．２-20０3 ２. 术语和定义

菌落总数是指食品检样经处理后，在一定条件下培养后(如营养成分、培养温度和时间、ｐH、需氧性质等),所得1ml(g)检样中所生长的细菌菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌,由于现有的生长条件不能满足其生理要求，故难以生长。因此菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数。

菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中的繁殖动态,以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 ３. 仪器及器材

3.1 恒温培养箱：3６±1℃; 3.２ 冰箱：０～4℃; 3.3 恒温水浴锅：46±1℃; 3.４ 天平； 3.5 电炉; 3.6 灭菌吸管；

3.7 灭菌广口瓶或三角瓶:容量为500ml； 3．8 玻璃珠:直径5mｍ； 3.9 灭菌平皿：直径约9０ｍm； 3．10 灭菌试管; 3.1１ 放大镜； 3.12 菌落计数器； 3.13 酒精灯；

3．１4 均质器或乳钵; 3.15 试管架; 3.16 灭菌刀或剪子； 3．１7 灭菌镊子。 4. 培养基和试剂

4.１ 营养琼脂培养基; 4．２ 生理盐水； 4.3 7５％乙醇溶液。 5. 检验程序

菌落总数的检验程序如下：

菌落计数 ３6±1℃ 4８±２ｈ 每个皿内加入适量营养琼脂 选择2-3个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿中 做成几个适当倍数的稀释液 检样

6. 方法

6.1 检样稀释及培养

报 告 6.1.1 以无菌操作将检样25g（或ml）剪碎放于装有２25ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内,（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成１:10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8００0~1００00ｒ/mｉｎ的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。

6.1.２ 用1ｍl灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9mｌ灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液)振摇试管,混合均匀,做成1：100的稀释液。

６.1.3 另取１ml灭菌吸管,按上述操作顺序,做1０倍递增稀释液,如此每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。

6.1．4 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择２~3个适宜稀释

度,分别在做10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移１mｌ稀释液于灭菌平皿内。

6.１.５ 稀释液移入平皿后,应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基（可放置于４6±1℃水浴中保温)注入平皿约１5ｍl,并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内做空白对照。

6．1.6 待琼脂凝固后，翻转平板,置36±1℃培养箱内培养48±2ｈ。 注:如果怀疑样品中含有在琼脂培养基表面蔓延生长的菌落之，琼脂凝固后,可在表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4ｍL）,并在报告上记录该操作。 6．2 菌落计数方法

做平板菌落计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 6.3 菌落计数的报告 6．3.1 平板菌落数的选择

选取菌落数在30～30０之间的平板作为菌落总数的测定标准,一个稀释度选用两个平板,应采用两个平板平均数,其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘２代表全皿菌落数。平板内有链状菌落生长时(菌落之间无明显界限）,若仅有一条链，可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。 6.3.2 稀释度的选择

6．3.2．1 应选择平均菌落数在３0~30０之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之(见表中例１）。

6.3.2.２ 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30~300之间,则视两者的比值来确定。若其比值小于或等于２，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字,(见表中例２及3）。

6.3.２.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告(见表中例4）。

6.3.2.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例5）。

6.3.2．5 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告（见表中例6）。

６.3.２.6 若所有稀释度的平均菌落数均不在３0~300之间,其中一部分大于３00或小于30时，则以最接近３０或３0０的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表中例7)。

6．3.3 菌落数的报告

菌落数在100以内时,按其实有数报告，大于10０时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面得数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数,也可用1０的指数来表示(见表1)。

表1 稀释度选择及菌落数报告方式

稀释液及菌落数 例次 10－1 -2 -3 1010两稀释 液之比 — 1.６ 2.2 — — — — 菌落总数 cｆu/ｇ或ml 164０0 37750 27１0０ ３ 270 ＜１×10 报告方式 cfu/ｇ或ml 1６000或1．６×1０４ 38０0０或3．8×104 2７000或２．7×410 或3.１×1０5 2７０或2.7×10２ １ 2 3 ４ 5 6 7

多不可计 多不可计 多不可计 1６4 ２95 ２7１ 20 46 60 313 5 0 12 多不可计 多不可计 ２7 0 多不可计 11 0 305 ＜１0 310００或3．1×３０5００ 104 7. 注意事项

７.１ 培养基温度应在４6±1℃,温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝固而不能与菌液充分混合，琼脂应放在水浴锅内，温度为4６±1℃。

７.2 尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落,否则将会导致重大的技术误差。

7.3 检样稀释后,应尽快接种，倾到培养基。一般从检样稀释开始到倾到培养基,应在１５mｉn内操作完毕。

注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和,往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌

落少而高稀释度使菌落反而增大。

７.４ 对照试验。为了避免微小颗粒与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板,不经培养放到4℃环境中,以便计数菌落时用作对照。 7.5 培养湿度。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48ｈ后,培养基失重不应超过15％。

８. 菌落计数及报告注意事项

８.１ 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 8.2 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

8．3 如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，有两种可能性：一是检验工作中发生差错;二是受防腐剂影响。这二种情况均不可用作检样计数报告的依据。

８.4 如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细胞块被分散所造成。一条链作为一个菌落计,如有来源不同的几条链,每条链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落,也不应分开来数。

8.5 如果所有平板上都菌落密布,不要用多不可计报告，而应在稀释最大的平板上,任意数其中两个平方厘米中的菌落数,除以2求出ｌcｍ2内平均菌落数，乘以皿底面积６3．6cm2,再乘以其稀释倍数，以此结果作报告,例如:10-1～10-３稀释度的所有平板上均菌落密布,而在１0-3稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每克(或ml)中“估计”菌落数为： 60÷2×6３．6×10０0=1．９×106。63．6是按皿底直径为9ｃm时计算而得的面积，如所用平皿底直径不是９cm，应另求面积。、

8.6 称重取样以cfｕ／g为单位报告,按体积取样的以cfu/ｍｌ为单位报告,表面取样则以cfu/cm２ 报告。

二、方法2：3M 纸片法

请按照3M Pｅtrifilm PCA菌落总数测试片的说明书进行操作。

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乳与乳制品微生物检验食品中大肠菌群的检测 YＬNB 3.2

１、引用依据:GB/T4789.3-２003 2、术语和定义

大肠菌群:指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100mｌ(ｇ)检样内大肠菌群最可能数（ＭPN）表示。 3、 仪器及器材

3.１ 恒温培养箱：36±1℃； 3.2 冰箱:０－4℃;

3.3 恒温水浴锅：４6±１℃； ３．4 天平; ３.5 显微镜； 3.6 均质器或乳钵； ３．7 灭菌平皿：直径90mm;

３.8 灭菌试管：18×1８0和20×200； 3．9 灭菌吸管：1 ｍｌ和10 ml；

３．10 灭菌广口瓶或三角烧瓶:容量为５0０ml； 3.11 灭菌玻璃珠：直径约5mm; 3．１2 载玻片； ３.13 酒精灯; 3.14 试管架;

3.15 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。 ４、培养基和试剂 4.1 乳糖胆盐发酵管； 4．2 伊红美兰琼脂平板； 4．3 乳糖发酵管; ４.4 生理盐水； 4.5 革兰氏染色液。 5、检验程序

大肠菌群检验程序: 检样 稀释 乳糖胆盐发酵管 36±1℃，24±2h 不产气 产气 大肠菌群阴性 伊红美兰琼脂平板 36±1℃，18~24h 报告 革兰氏染色 乳糖发酵管 36±1℃，24±2h 革兰氏阳性 革兰氏阴性无芽孢杆菌 产气 不产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 报告 报告 报告 6、方法 6.1 检样稀释

６.1．1 以无菌操作将检样２5ｍl（或g)放于装有２２5ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:1０的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以800０~1０000r／ｍｉｎ的速度处理１min,做成1：1０的均匀稀释液。

６.１.２ 用1mｌ灭菌吸管吸取1:10稀释液1ｍｌ，注入含有9mｌ灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成１:100的稀释液。

6.１．3 另取1ml灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次,换用一支１ml灭菌吸管。

6.1．4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。

6.２ 乳糖发酵实验：（通常所说的假定试验:其目的在于检查样品中有无发酵产生气体的细菌）

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ｍl以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种３管，置36±1℃培养箱内,培养24±2ｈ,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

６.３ 分离培养：(目的在于检查乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内,有无需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌存在)

将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36±１℃培养箱内,培养18~２4h,然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。

6.4 证实实验(复发酵实验): (目的在于证明从乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌,确能发酵乳糖产生气体)

在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~２个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃培养箱内,培养2４±２h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阴性。 ６．5 报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数查ＭPN检索表,报告每１0０ｍｌ(ｇ）大肠菌群的最可能数（见表１)。 7、注意事项

7.1 初发酵和证实试验

乳糖发酵试验不是纯菌的发酵试验,所以初发酵阳性并不代表大肠菌群阳性，因此,必须作进一步证实试验。 7.2 产气量与倒管

试验表明,大肠菌群的产气量与大肠菌群的检出率呈正相关系。但也随样品的种类而变。大肠菌群的产气量多者可充满整个倒气管,少者可产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵管如有疑问，可用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生,而应作进一步试验。另外,产气量与倒

气管有一定的关系，倒气管口不完整,有利于气体的进入;管口周围有沉淀等物质能影响气体的进入。 7.３ 挑选菌落

在平板呈现紫黑色,有或无金属光泽,检出率最高；粉红色、粉色检出率最低。另外，只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率,当菌落不典型时,应挑取2～３个菌落作证实试验,以免出现假阴性。 7.４ 抑菌剂

大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。胆盐的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响,因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法添加。 7.５指示剂

溴甲酚紫属于酸碱指示剂,其pH变色范围为:黄5．2~６.8紫，当料管中培养基（pH＝7．4±0.1)的颜色由紫色变为黄色时，证明培养基中有酸性物质产生,此时培养基的PH≤5.２,培养基呈酸性。 ７．6 MPN检索表

MＰN为最大可能数的简称，表示样品中活菌的密度,是用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。ＭＰＮ检索表只给出了三个稀释度,如果改用不同的稀释度,则表内数值应相应降低或增加10倍。

7.6.１ 用于初发酵试验或复发酵试验的小导管内应无气泡,有气泡时就不能使用,接种之后,要用同批未接种的发酵管置于温箱内,同时培养,作为空白。 7．６.2 检查初发酵试验的乳糖胆盐管内是否有乳糖分解菌存在时，应以产气为主,产酸仅作参考。因为培养基中所用的指示剂为溴甲酚紫，其有效ＰH为5.２-6.8,变色点为６.0,如果产酸未能达到使下降至6.0以下时，变色就不显著。 7.6．3 检查发酵管中小导管内气泡时,即使只有微量气泡出现，亦应判定为阳性。有时小导管的管口被样品颗粒封住,气体未能进入导管,如加以振摇,管低有小气泡上升，亦应视为阳性。

7.6.4 大肠菌群细菌能分解乳糖产酸，使伊红和美兰结合而成黑色物，故菌落呈紫黑色（大肠杆菌）或褐色(产气克雷伯氏菌等），前者有时还产生有金属光泽。

表1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表

阳性管数 1 1０-1 10-2 ０ 0 ０ ０ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 １ 1 1 1 1 1 １ １ 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 ０ 1 1 1 1 2 2 ２ ２ 3 3 3 3 ０ ０ ０ 0 1 1 1 1 2 2 2 ２ 3 3 ３ 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 ２ ３ 0 1 2 3 0 1 2 3 ０ 1 2 ３ 0 １ 2 3 0 1 2 ３ MPN １00ｍl(g) 阳性管数 1 １０1０-2 -1 ＭPN 1００ｍl(g） <30 ３0 ６0 90 30 60 90 １20 ６０ 9０ １2０ 160 9０ 130 １6０ １９0 40 70 11０ 1５0 70 110 １50 １90 110 150 2０0 24０ 16０ 2０0 2４0 290 ２ ２ 2 2 ２ 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ２ ３ 3 ３ 3 ３ 3 3 3 3 ３ 3 3 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 ２ 2 2 3 3 ３ ３ 0 ０ 0 0 1 1 1 1 ２ 2 ２ 2 3 3 3 ３ ０ １ 2 3 0 1 2 3 ０ 1 2 3 ０ 1 2 ３ ０ １ 2 ３ 0 １ 2 3 ０ １ 2 3 0 1 2 ３ 90 １4０ ２00 ２６0 15０ 200 2７0 340 210 28０ 350 420 ２９0 360 440 530 ２３0 390 64０ 950 43０ ７5０ １２00 160０ 930 15００ 2100 ２９00 2４0０ 46０0 11000 ≥２4０００ 注：①本表采用3个稀释度【0.1ｇ(mL)、0.01 g(ｍＬ)、0.0０1 g(mL)】、每个稀释度接种３管。

②表内所列检样量如改用1ｇ(ｍL)、０. １ g(mL)、0.01 g（ｍL)时，表内数字相应降低10倍；如改用0.01g(ｍL)、0.0０1 g(mL)、０.0001 g(mL) 时，

表内数字相应增加10倍，其余类推。

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乳与乳制品微生物检验方法

嗜冷菌的检测 YLNB 3.３

方法一：（仲裁法)

1、引用依据：IDF标准1０1Ａ：1991——乳中嗜冷菌的检验，6.5℃，培养10天 2、范围

此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。 3、试剂与培养基 3.１ 生理盐水；

3.2 培养基：平板计数琼脂2３.5ｇ+脱脂奶粉１g,溶于100ｍl蒸馏水中。必要时用滤纸过滤。调节ｐH值为6．9±０．1℃。将培养基分装倒入三角瓶中,每瓶100－１５0ｍｌ。在12１±１℃下灭菌15mｉｎ,如果培养基马上要用,用水浴锅冷却到４６±１℃。如果不是,则为了不耽误培养基的使用,在实验开始前,将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化,然后再放入水浴中冷却到46±１℃。 注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。 ４、仪器及器材

４.1 恒温培养箱:3６±1℃； 4.２ 冰箱：0-４℃； ４．3 恒温水浴锅:46±1℃; 4.4 天平；

４．5 均质器或乳钵； 4．6灭菌平皿:直径９０mm；

4.7 灭菌试管:１８×180和20×200； 4．8 灭菌吸管:１ ml和1０ mｌ；

４.９ 灭菌广口瓶或三角烧瓶:容量为500mｌ； 4.10 灭菌玻璃珠:直径约5mｍ； 4．11 酒精灯; 4.1２ 试管架；

４.13 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等;

４．14 ｐH计。 ５、方法

5.1样品的稀释及培养

5．１．1 以无菌操作,将２5ml样品注入含有22５mｌ灭菌生理盐水的三角瓶内，充分混匀,制成1:１0的稀释液。

5.1.２ 用1mｌ灭菌吸管吸取1:10的稀释液１ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内,充分混匀,制成1：100的稀释液。

5.1.3 另取１ml灭菌吸管,按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次,即换用1支吸管。

５.1.4 根据对样品污染情况的估计，选择2～３个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移取１ml稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。

注：其他稀释方法可以使用，例如第一步稀释可以是1０ｍl检测样品注入到90ｍl稀释液中，或11mｌ检测样品注入到99ｍl稀释液中。当样品和稀释液用量更大,方法的精密度和准确度就更高。

5.1.5稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的培养基（可放置于4６±1℃水浴保温）注入平皿约15ml，并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入空的灭菌平皿内作空白对照。

注:从稀释样品到倾倒培养基，整个操作过程不应超过15ｍiｎ。 5.1.6 待培养基凝固，翻转平板，放入6.5℃培养箱内培养10天。

注:每叠皿不应超过6个,每叠皿之间以及与培养箱的壁之间应保持一定的间隙。 5．2 菌落计数方法

对平皿进行菌落计数时,应在柔和的光线下计数。为了便于计数,可使用适当的放大镜和（或)菌落计数器。以防极小的菌落遗漏，以及避免将平皿中杂质颗粒进行计数。仔细检查可疑的物质,如需要可使用更高倍数的放大镜，以区别菌落和外来物质。

5.3 菌落计数的报告 ５．3.１ 平板菌落数的选择

平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作

为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内若有链状菌落生长时(菌落之间无明显界限），若仅有一条链，可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。 ５.3．2 稀释度的选择及报告

5.3．2.１ 选取菌落数在1０-3０0之间的培养皿作为计数的测定标准。 5.3.2．2 若有两个稀释度,其生长的菌落数在10-30０之间，则按下面的方法计数。

计算每ml牛奶中微生物的个数N，用以下的公式：

Ｎ＝

n10.1n2dC

这里∑c： 是所有皿上菌落数的总和。

n1： 是第一个稀释度培养皿的个数。 n２: 是第二个稀释度培养皿的个数。 d: 是与第一个稀释液相对应的稀释因子

结果保留两位有效数字,后面的数字以四舍五入计算。当第三位数是５时,看其左边的数是奇偶数进行数字取舍;如285０0进行数字取舍为280０0,１1500为12000。

结果以科学计数法表示。 举例

微生物计数给出以下的结果(包括两个带盖培养皿)： 在第一个稀释度(１0-２):１68和２15个菌落 在第二个稀释度(10－３):１4和２5个菌落

Nn10.1n2dC168215142542219182

20.121020.022根据上面所说结果进行取舍为19000,结果为１.9×１04个/ml。

注：如果有两个以上可以计数的稀释度,公式应修改为用多个稀释度进行计算。如为三个稀释度，由下面的公式可计算出每毫升中微生物的数量。

Nn10.1n20.01n3dC

5.3.２.3 如果菌落数均小于10,则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数,报告每毫升牛奶菌落的估计数。

5.３.2.４ 如果菌落数均超过300，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数，报告每毫升牛奶菌落的估计数。 方法二：(快速法）

1、引用依据:IDF标准132A——乳中嗜冷菌快速检测方法，21℃，25h。 2、范围

本标准描述的是通过21℃时快速菌落计数技术进行嗜冷菌菌数估算的方法。 此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验—当需要很快的得到嗜冷菌估算值的时候。 3、试剂与培养基 3.1 稀释液

生理盐水：0.8５％的氯化钠水溶液，灭菌。 3.２ 培养基

平板计数琼脂2３．5g＋脱脂奶粉１g，溶于１0００ml水中。必要时用滤纸过滤。调节pH值为6．9±0.１。将培养基分装倒入三角瓶中,每瓶10０—15０ml。在121±１℃下灭菌15mｉn,如果培养基马上要用,用水浴锅冷却到46±1℃。如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1℃。 注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。 4、仪器及器材 4.1 培养箱:21±1℃ 4.2 ｐＨ计

４．3 水浴:4６±１℃

4．4 三角瓶:250—3０0ｍｌ，带合适的塞子。 4．5 灭菌吸管：1 ｍｌ和10 ml； 4.6灭菌培养皿：90—１０0mm ５、方法

５.1样品的稀释及培养 稀释步骤同方法一。

待培养基凝固翻转平板,放入２1℃培养箱内培养25ｈ。 5．２菌落计数方法 同方法一。

5.３ 菌落计数的报告 同方法一。

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乳与乳制品微生物检验方法

霉菌和酵母菌的计数 YＬ

NB 3.４ 1、引用依据:ＧＢ/T4７8９.15-2０03 2、仪器及器材

2.1 恒温培养箱：36±１℃; 2.２ 冰箱：0-4℃； 2．3 恒温水浴锅：4６±1℃； 2.4 天平； 2．5 显微镜; ２．6 均质器或乳钵; 2.7 灭菌平皿：直径９0mm;

2.8 灭菌试管：18×1８０和20×20０； 2.９ 灭菌吸管:1 ml和10 ｍl;

２.10 灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为50０ml； 2.１１ 灭菌玻璃珠：直径约５ｍｍ; 2.12 载玻片; 2.13 酒精灯； ２.14 试管架；

２.15 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。 3、 培养基和试剂

在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。

3.１ 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA）：需加入适量抗菌素以抑制细菌; 3.２ 孟加拉红（虎红)培养基; ３.3 高盐察氏培养基; 3.4 灭菌蒸馏水; 3.５ 7５％乙醇溶液。 4、 检验程序 检验程序如下:

检样 块状食品 糊状食品 粮食 粉状食品 液状食品 称取25g，加225ml无菌水 吸取25ml,加225ml无菌水 做成几个适当倍数的稀释度 选择2~3个适宜稀释度，各以1ml加入灭菌平皿内 每皿加入适量培养基（可选用马铃薯—葡萄糖琼脂附加抗菌素、高盐察 氏培养基，或孟加拉红培养基） ２5~28℃ 5d 菌落计 报告

5、 方法

5．1 以无菌操作称取检验２5ｇ（或２5ml)，放入含有225ml灭菌水的玻赛三角瓶中,振摇３0分钟,即为1:10稀释液。

5.２ 用灭菌吸管吸取1:10稀释液10ml，注入试管中,用带橡皮乳头的1mｌ吸管反复吹吸50次,使霉菌孢子充分散开。

5.3 取1ml 1：1０稀释液注入含有９ｍｌ灭菌水的试管中,另换一支１ml吸管吹吸５次,此液为1:１0０稀释液。

5.4 按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1ｍl吸管，根据对样品的污染程度，选择2～3个合适的稀释度，分别做10倍稀释的同时,吸取1ml稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度做２个平皿，然后将凉至４5℃左右的培养基注入平皿内，待琼脂凝固后,翻转平板,将其置于25～2８℃的培养箱中,3天后开始观察，共培养观察５天。

5.5 计数方法：通常选择菌落数在10~150之间的平皿进行计数,同一稀释度的两个平皿的菌落数的平均值乘以稀释倍数,即位每克或每毫升检验中所含霉菌和酵母菌数。关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落总数测定。

5.6 报告:每克或每毫升食品所含霉菌和酵母菌以个/克（个/毫升）表示。

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乳与乳制品微生物检验

3.５ 方法一:

1. 引用依据:GB/Ｔ4７８9.２7-２0０３ 2. 范围

本方法适用于能杀灭嗜热乳酸链球菌的各种常用抗生素的检验 3． 仪器及器材 2.1 冰箱：４℃~-20℃; 2．2 恒温培养箱:３６±1℃;

２.３ 恒温水浴锅：36±１℃、７９±１℃； ２.4 天平;

2．5 灭菌吸管:１ml、1０ ml; 2.６ 灭菌试管:16mm×１６0ｍm； 2.7 １０0 ℃温度计； ２.8 蜡笔；

2.9 灭菌广口瓶或三角烧瓶：容量为50０ｍl； 2．１0 灭菌玻璃珠:直径约5mｍ; ２.11 酒精灯； 2．１２ 试管架；

鲜乳中抗生素残留检测 YLNB

2.13 灭菌刀、剪子、灭菌镊子等。 4. 菌种、培养基和试剂 3.1 菌种:嗜热乳酸链球菌。 ３．2 脱脂乳:经113℃灭菌20miｎ。

3.3 4％２，3，5-氯化三苯四氮唑(ＴＴC）水溶液:称取1ｇTＴＣ，溶于5ml灭菌蒸馏水中，装褐色瓶内于7℃冰箱保存,临用时用灭菌蒸馏水稀释至五倍。如遇溶液变为玉色或淡褐色,则不能再使用。 5. 检验程序

鲜乳中抗生素残留检验程序见下图。 显色者 抗生素阴

６. 方法

检样 80℃，加热5min 冷却37℃以下 加菌液，36±1℃水浴2h 加TTC指示剂，36±1℃水浴30min 不显色 红色 36±1℃水浴30min 报告 不显色者 抗生素阳性 抗生素阴性 报告 6．1 菌液制备:将菌液移种脱脂乳,经36±1℃培养15ｈ后，以灭菌脱脂乳1：1稀释待用。

6.２ 取检样９ml于试管内，80℃水浴加热5min冷却37℃以下，加菌液1mｌ,3６±１℃水浴培养2h，加TTC 0.３ｍl, ３6±1℃水浴培养30miｎ,观察如为阳性，再于水浴中培养30min作第二次观察,每份检样作两份,另外再作阴性和阳性对照各一份,阳性对照管用无抗生素的乳8ml加抗生素及菌液和TＴＣ。阴性对照管用无抗生素乳9ml加菌液和ＴＴC。

7. 判断方法：准确培养3０ｍin观察结果,如为阳性，再继续培养30ｍｉn作第二次观察。观察时要迅速，避免光照过久发生干扰。乳中有抗生素存在,则检样中虽加菌液培养物,但因细菌的繁殖受到抑制，因此指示剂ＴTＣ不还原，不显色。与此相反，如果没用抗生素存在,则加入菌液即行增殖,TTC被还原而显红色,也就是说检样呈乳的原色为阳性，呈红色为阴性。具体内容见表1和表2。

表1 显色状态判断标准

显 色 状 态 未显色者 微红色者 桃红色－红色

表2检测各种抗生素的灵敏度 抗 生 素 名 称 最 低 捡 出 量 青霉素 0.004单位 链霉素 0.5单位 庆大霉素 ０.4单位 卡那霉素 5单位 方法二:抗生素检测试剂盒

具体操作请参照试剂盒说明书

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判 断 阳性 可疑 阴性

乳与乳制品微生物检验方法

芽孢和耐热芽孢的检测 YLNB 3.6 １. 术语

我们通常所指的耐热芽孢杆菌是指对灭菌温度或更高的温度具有极强的抵抗力的一组能够形成芽孢的细菌。 2. 仪器及器材

2．1 培养箱：３0~35℃，50～５5℃，；

２.2 恒温水浴锅：4６±1℃,80±1℃， １０0±1℃； 2.3 平皿：直径９0mm; 2.4 试管，吸管；

2.５ 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mｌ； 2.6 温度计。 3. 培养基和试剂

3．1生理盐水(0．85%NａCL溶液) 3．2营养琼脂或孢子计数专用培养基 ４． 方法

4．1 芽孢总数的测定: 检验程序见下图

80℃，水浴10min 迅速冷却 检样 做成几个适当倍数的稀释液

30～3５℃ ７2h

4.1.１ 样品的前处理

4.1．１.1以无菌操作将5－10ｍl原奶样品加入一具塞灭菌试管内，在另一试管加入与奶等量的水，并在加水的试管中插入一根温度计。

４.１.1.2将两支试管同时放入80℃的恒温水浴中,待温度升至8０℃后,保温１０mｉn。

4.1.２ 样品的稀释及培养

4.１.2.1保温结束后，将含原奶的试管用冷水迅速冷却。

4.1.2.2根据样品的污染程度,选择２个适当的稀释度,分别做１0倍递增稀释的同时,即取该稀释度的吸管移1mｌ稀释液与灭菌平皿内,每个稀释度做2个平皿。 4.1．2．3 稀释液移入平皿后，即使将凉至46℃的培养基注入平皿内，使其混合均匀。同时做空白对照实验。

4．1.2.4 待琼脂凝固后，翻转平板，置３0－3５℃培养箱下培养7２h。 4.１．2.３.菌落计数方法参见菌落总数的计数方法。 4.１．2.4 菌落数的报告参见菌落总数的报告方式。 ４.2 耐热芽孢总数的测定 检验程序见下图

做成几个适当倍数的稀释液 迅速冷却 检样 100℃，水浴10min 选择2-3个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿，每个稀释度做4个平皿，分成2组

30～３5℃ 72h 5０~55℃ 7２ｈ

4.2.1样品的前处理

4.2.１.1以无菌操作将5～1０ml原奶样品加入一具塞灭菌试管中，在另一试管加入与奶等量的水，并在加水的试管中插入一根温度计。

4.2.1.2将两支试管同时放入10０℃的恒温水浴中,待温度升至100℃后，保温10min。如果水达不到100℃就沸腾，则等待时间需延长。或在水中加入盐以提高沸点温度,但要避免原奶样品沸腾。 4．2.2样品的稀释及培养

4.2.2.1保温结束后，将含原奶的试管用冷水迅速冷却。

４.2．2．2根据样品的污染程度，选择2个适当的稀释度,分别做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液与灭菌平皿内,每个稀释度做4个平皿,分成2组，每组2个平皿。

4.2．2．3稀释液移入平皿后,即将凉至46℃的培养基注入平皿内,使其混合均匀。同时做空白对照实验。

４.2.2.４待琼脂凝固后，翻转平板,将1组平皿置于30~35℃培养箱,另一组放入５0~５5℃培养箱内，均培养72h。

4．2.３菌落计数方法参见菌落总数的计数方法。 4.2.4菌落数的报告参见菌落总数的报告方式。

在30－35℃条件下培养的菌落数为耐热适中温菌的芽孢数，而在50-５5℃条件下培养的菌落数为耐热嗜热型的芽孢数。计数两个温度下的总和为每毫升测试样品中的总耐热芽孢总数。

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乳与乳制品微生物检验方法

双歧杆菌的检验 YLNＢ

3.7 １、引用依据：GB/Ｔ4７89．３4-2003 2、术语和定义

双歧杆菌:一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸,不形成芽孢,不运动,细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。 3、 仪器及器材 3．1培养箱:36±1℃; 3．2 恒温水浴：46±1℃; 3.３显微镜; ３.4厌氧培养箱; 3．5离心机; 3．6 天平; ３.7电炉； 3．8吸管；

３.９ 广口瓶或三角瓶:容量为500ml; 3.10 平皿:直径约９0mｍ; 3.11 试管； ３．12 酒精灯; 3.13 灭菌刀或剪子;

3.14 灭菌镊子。 4、培养基和试剂 4.1 生理盐水; ４.2 75％乙醇溶液; ４.3 TＰＹ琼脂培养基; 4.4 ＢＬ琼脂培养基； 4.５ BＢL 琼脂培养基； 4.6双歧杆菌生化用基础培养基 ； 4.7 PYG液体培养基； ４．8革兰氏染色液； 4.9灭菌液体石蜡。 5． 检验程序

25g（mL）检样加225mL灭菌生理盐水，做成几个适当倍数的稀释液 选择2—3个适当稀释度，各取0.1mL分别涂布于BL,BBL,TPY培养基 厌氧培养 36±1℃ 72h±3h 分纯 革兰氏染色，过氧化氢酶试验 菌落计数报告 接受PYG厌氧培养 37℃ 72 h 生化培养观察10天 测定乙酸、乳酸 菌中鉴定报6、方法

6.1以无菌操作将充分混匀的检样２5ｇ(ｍl)放入含有22５ml灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内做成1：10的均匀稀释液。

6.２ 用1 ｍl灭菌吸管吸取1:1０稀释液1 ml,沿管壁徐徐注入含有９ mｌ灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，作成１:100的稀释液。

6.3 另取1 mｌ灭菌吸管，按上述操作顺序,作1０倍递增稀释液,如此每递增一次,即换用１支１ml灭菌吸管。

6.4选取2个~3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时,各取0.1mｌ分别加入计数培养基平皿，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。最好同时选用2种~3种培养基(BL、BBL、TPＹ培养基)，同时作灭菌生理盐水空白对照。 ６.5待琼脂表面干后,翻转平皿，放置厌氧罐内，操作全过程须在20ｍiｎ内完成。 ６．6将厌氧罐置36℃±1℃温箱内培养培养72ｈ±3h，观察双歧杆菌菌落特征见表1。选择菌落数在30~3０0之间的平板对可疑菌落进行计数,随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色,显微镜检查和过氧化氢酶试验。过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性,无芽孢,着色不均匀，出现“Y”或“V”型的分叉状、或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌。

表1 双歧杆菌在不同培养基上菌落生化形态特征 培养基 BＬ培养基为黄色 双歧杆菌特征 菌落中等大小,表面光亮,边缘整齐呈瓷白色、奶油色,质地柔软、细腻 BBＬ培养基为黄色 菌落中等大小,表面光滑、凸起，边缘整齐呈奶油色，质地柔软、细腻 TPY培养基为黄色 菌落表面光滑，凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软、细腻

6．7菌落计数：根据证实为双歧杆菌的菌落数,计算出平皿内的双歧杆菌数,然后乘以样品的稀释倍数,得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果。例如,检样1×104 倍的稀释液在BBＬ琼脂平板上,生成的可疑菌落为35个,取５个鉴定,证实为双歧杆菌的是４个,则1ｍl样品中双歧杆菌数为：

10 ×35×4/5×1０4 =2.８×1０6

７、双歧杆菌菌种鉴定

具体操作请参照对应的生化鉴定试剂盒的说明书。

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乳与乳制品微生物检验方法

染色技术 YLNB

３.8

1、染色的基本原理

等电点学说:细菌的等电点较低，pH值大约在2～5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷,而碱性染料电离时染料离子带阳电。因此，带阴电的细菌常与带阳电的碱性染料进行结合。所以,在细菌学上常用碱性染料进行染色。

通透性学说：革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌均让结晶紫染色液与碘液通过,进入菌体后,碘液与染料结合成一种不溶于水,只溶于酒精的化合物，这种化合物能渗出革兰氏阴性菌体外而不能渗出革兰氏阳性菌体外，这样革兰氏阳性菌仍保留结晶紫和碘化合物的颜色而呈紫色，而革兰氏阴性菌则被脱色,复染后呈复燃的粉红色。

2、制片和染色的基本程序

制片 干燥 固定 染色 媒染 脱色 复染 水洗 干燥 镜检 ２.1 制片

在干净的载玻片上滴一滴生理盐水,,用接种环进行无菌操作,挑取培养物少许，置载玻片的水滴中,与水混合做成悬液并涂成直径约1ｃｍ的薄层，为了避免因菌数过多聚成集团，不利观察个体形态,可在载玻片之一侧再加一滴水，从已涂

布的菌液中再取一环于此水滴中进行稀释，涂布成薄层。若材料为液体培养物,则直接涂布于载玻片上即可。 2.２ 自然干燥

涂片可在室温下自然干燥,也可在酒精灯上轻过几次，使水分蒸发，但切勿加热时间过长,温度过高,以防标本烤枯而变形。 2.3 固定

一般均用加热法,手执载玻片的一端（涂有标本的远端),标本向上，迅速通过酒精灯火焰外层2～3次,共约２~3秒钟,温度以载玻片反面接触皮肤，热而不烫为宜(不超过6０℃)。放置待冷后,进行染色。 2．4 染色

标本固定后滴加染色液。染色的时间各不相同,视标本与染料的性质而定,有时染色液还需加热。染料作用标本的时间平均约1~3分钟，而所有的染色时间内整个有标本的部分都应浸在染液中。

若做复合染色，在媒染处理时，媒染与染料形成不溶性化合物,可增加染料和细菌的亲和力。一般固定后媒染,但也可以结合固定或染色同时进行。 ２．5 脱色

用醇类或酸类处理染色的细胞，使之脱色。可检查染料与细胞结合的稳定程度，鉴别不同种类的细菌。常用的脱色剂是95％的乙醇和3%的盐酸溶液。 2.6 复染

脱色后再用一种染色剂进行染色，与不被脱色部位形成鲜明的对比,便于观察。 2．7 水洗

染色到一定的时候，用细小的水流从标本的侧面把染料冲掉，被菌体吸附的染料则被保留。 2.8 干燥

着色标本洗净后，将标本晾干,或用吸水纸把多余的水吸干，然后晾干或为热烘干，用吸水纸时，切勿使载玻片翻转，以免将菌体擦掉。 ２．9 镜检

3、染色液配制及染色法

３.1 吕氏美兰染色法 3．1.1染液的配制 吕氏美蓝染三色液：

美蓝 0.3ｇ ９５％体积分数的乙醇 30ml 0.１g／L氢氧化钾溶液 1０0ml 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。 3.1.2 染色方法

将涂片干燥后热固定,待冷。滴加染液，染1～3分钟,水洗，待干,镜检。 3.1．３ 观察结果：菌体呈蓝色。 ３.2 革兰氏染色法 3.2.１ 染液的配制 a．结晶紫染色液：

结晶紫 １g ９5%体积分数的乙醇 20ｍl １0g/L草酸铵水溶液 ８０ml 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 b.革兰氏碘液：

碘 １g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml

将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。 c．沙黄复染液:

沙黄 ０.25g 95%体积分数的乙醇 １０ml 蒸馏水 ９0ml 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。 3.2．2 染色方法：

a．将涂片干燥后，在火焰上热固定; b．滴加结晶紫染色液，作用１分钟,水洗; c．滴加革兰氏碘液,作用1分钟,水洗；

d．滴加95%体积分数的乙醇脱色,约３0秒；或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10秒，水洗; ｅ．滴加沙黄复染液，作用１分钟，水洗,待干,镜检。 3.２．3 观察结果:革兰氏阳性菌呈紫色;革兰氏阴性菌呈红色。 3.3 夹膜染色法 3.3．1 染液的配制

a. 结晶紫溶液 结晶紫饱乙醇溶液5mｌ加蒸馏水9５ml) b． 硫酸铜溶液 ２00g／L 3.3.2 染色方法:

a． 将有夹膜的细菌涂片，在空气中干燥,加热固定； ｂ. 滴加结晶紫染色液,在火焰上略微加热，冒蒸气为至; ｃ. 用200g/L硫酸铜溶液将涂片上的染液洗去，此时勿再用水洗; ｄ 用吸水纸吸干后镜检。 3.3.3 观察结果

菌体及背景呈红色，菌体周围有一圈淡紫色或无色的荚膜。 3.４ 芽孢染色法 ３.４.１ 染液的配制 ａ．石碳酸品红溶液：

碱性品红: 0.３ g 9５%体积分数的乙醇: 10ml 50g/L酚水溶液 90 mｌ 将品红溶解于乙醇中,然后与酚溶液混合 b．碱性美兰溶液 c．95％乙醇

3．４．２ 染色方法

a.将有芽孢的细菌涂片,干燥后热固定；

b.加石炭酸品红溶液，弱火加热,冒热气约5分钟,冷却后水洗； c.用95％的乙醇脱色2分钟,水洗； d．用碱性美兰溶液复染０.5分钟，水洗； e．待干，镜检。

3.4.3 结果观察:芽孢呈红色，菌体呈蓝色。

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乳与乳制品微生物检验方法

显微技术 YLNＢ

3.９

1. 普通光学显微镜的结构和基本原理 1.1结构

光学显微镜是由放大系统和机械装置两部分组成。光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等;机械系统一般包括镜筒、物镜状换器、镜台、镜臂和底座等。 1.2 原理

显微镜的放大效能是由所用光波长短和物镜数值口径决定,缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率,可见光的光波幅度比较窄,紫外光波长短可以提高分辨率,但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1,而香柏油的折射率为1．５1,和载玻片的玻璃折射率１.5２相近,这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香伯油进入物镜,从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。 ２. 普通显微镜的使用方法

2．1 低倍镜观察

先将低倍物镜的位置固定好,然后放置标本片,转动反光镜,调好光线，将物镜提高,向下调至看到标本,再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外,聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像,可以将聚光镜稍微下降,图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量,增加明暗差。 2.2 高倍镜观察

显微镜的设计一般是共焦点的。低倍镜对准焦点后,转换到高倍镜基本上也对准焦点,只要稍微转动微调即可。有些简易的显微镜不是共焦点，或者是由于物镜的更换而达不到共聚焦点，就要采取将高倍物镜下移，再向上调准焦点的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足够的光锥角度。稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。 2．3 油镜观察

油镜的工作距离很小，所以要防止载玻片和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、高倍到油镜。当高倍物镜对准标本后，再加油镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜,直接用油镜观察。显微镜有自动升降装置的，载玻片上加油以后,将油镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。没有自动止降装置的,对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。

使用油镜时，镜台要保持水平,防止油流动。油镜所用的油要洁净,聚光镜要提高到最高点,并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。 ３． 普通显微镜的保养

显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项: 3.1观察完后,移去观察的载玻片标本。

3.2用过油浸镜的,应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2～3次,最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。 3.3 转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。

3.４ 将镜身下降到最低位置,调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。

镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁,只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或纱布等擦镜头。物镜在必要时可以用溶剂清洗，但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。根据不同的胶固剂,可选用不同的溶剂,如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯，轻擦,并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。目镜是否清洁可以在显微镜下检视。转动目镜，如果视野中可以看到污点随着转动,则说明目镜已沾有污物,可用擦镜纸擦拭接目的透镜。如果还不能除去,再擦拭下面的透镜，擦过后用洗耳球将短绒吹去。在擦拭目镜或由于其他原因需要取下目镜时，都要用擦镜纸将镜筒的口盖好,以防灰尘进入镜筒内，落在镜筒下面的物镜上。 4．显微计数

利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。

血球计数器是一只特制载玻片。载玻片上有两个方格网,每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数,所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种,一种是每个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格。另一种是一个大方格分25个中方格，每个中方格又分成1６个小方格，不论哪一种,一个大方格，都等分成（25×16或16×2５）４0０个小方格。因为每个大方格边长为１毫米，载玻片与盖片间距离为０.1mｍ,所以每个计数室(1个大方格)体积为0.1mm³。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出１毫升菌液内所含的菌数。

一个大方格是1６个中方格时，应当数4角４个中方格（即100个小方格）的菌数,一个大方格是２５个中方格时，除取４角4个中方格外,还要数中央一个中方格（即为80个小方格）的菌数。

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乳与乳制品病原微生物检验方法

金黄色葡萄球菌的检验 YＬNＢ

４.1 方法一：国标法 1. 仪器及器材 1.1 冰箱:０-４℃

1.2 恒温培养箱：36℃±1℃ 1.3 显微镜:10×——1０0× 1.4 均质器或灭菌乳钵。 1.5 天平：0-500g,精度0.5g

1.6 灭菌试管:10mm×１00mｍ、1６mm×１60mｍ

1.7 灭菌吸管：１mｌ(具０.01mｌ刻度）、１0ml（具0.1ml刻度) 1.8 灭菌锥形瓶：500ｍl、１0０mｌ 1.9 灭菌培养皿：直径90cｍ 1.10 1.11

灭菌Ｌ型涂布棒 灭菌刀、剪子、镊子等

2. 培养基和试剂

2.1 胰酪胨大豆肉汤:按GB／T4７８9.２8－２0０3中4.59规定 2.2 7.5%氯化钠肉汤：按GB/T4789．28-２０03中４．61规定 2.3 血琼脂平板:按GB/Ｔ4789.28－20０３中4．6规定

2.4 Baid-Paｒｋer琼脂平板：按GB／T４78９.２８-2003中4.6０规定 2.5 肉浸液肉汤：按GＢ/T47８9.2８－２003中4.1规定 2.6 0．8５%灭菌生理盐水。

2.7 兔血浆：按GB／T4789.28-2003中4.6３规定 3. 检验程序：

检样25g(ml)+225ml灭菌生理盐水

直接计数方法 增菌培养方法 7.5％氯化钠肉汤或 Baid-Parker平板 胰酪胨大豆肉汤 0.3ml、0.3ml、0.4ml 36℃±１℃ ２4hﻩ３6℃±１℃ 2４ｈ 血平板，Baid-Parker平板 血平板 ﻩ3６℃±１℃ 24h ３６℃±1℃ ２4h 涂片染色 观察溶血 血浆凝固酶试验

报告 4. 方法 4.1 增菌培养法

4．２ 检样处理：按无菌操作取检样２5g(ml），加入225ml灭菌生理盐水,固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。

4．3 增菌及分离培养:吸取5ml上述混悬液，接种于7.５%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤５０ml培养基内，3６℃±1℃培养24h,转种于血平板和Baid-Pａrker平板，３6℃±1℃培养2４h，挑取血平板上金黄色(有时为白色)菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

4.４ 形态:本菌为革兰氏阳性球菌,排列成葡萄球状,无芽孢，无荚膜,致病性葡萄球菌的菌体较小,直径约为0.5uｍ——１um.

4.５ 在肉汤中呈混浊生长,在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清,菌量多时呈混浊生长,血平板上菌落呈金黄色，有时也为白色,大而凸起,圆形，不透明,表面光滑,周围有溶血圈。在Ｂａid-Pａｒker平板为圆形,光滑凸起,湿润、直径为2mm——3mm,颜色呈黑色到灰色，边缘为淡色,周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶尔会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。

4．6 血浆凝固酶试验：吸取1:4新鲜兔血浆０.5ml，放入小试管中,在加入培养24ｈ的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml,振荡摇匀,置３6℃±1℃温箱或水浴内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固,即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块者,被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。 5. 直接计数方法

5．1 吸取上述1:10混悬液,进行,进行10倍递次稀释,根据样品污染情况,选择不同浓度的稀释液1ml,分别加入3块Baiｄ－Paｒｋｅr平板，每个平板接种量分别为0.3ｍl、0.3ｍｌ、0．4ml然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在36℃±1℃1h，等水分蒸发后反转平皿置3６℃±1℃培养。 5.2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落,并从中任选5个菌落,分别接种血平板,36℃±1℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养

法。

5.3 菌落计数:将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加,乘以血浆凝固酶阳性数,除以5，再乘以稀释倍数,即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。 方法二:纸片法

1. 仪器及器材：同方法一中的设备和材料。 2． 培养基和试剂 2.1 0.85％灭菌生理盐水

2.2 ３M Ｐetｒiｆｉlm (第二代)金黄色葡萄球菌快速检验测试片和确认反应片。按

照操作说明进行贮藏。 3. 方法

3.1 检样处理：按无菌操作取检样25g（ml）,加入２2５ml灭菌生理盐水,固体样 品研磨或置均质器中制成混悬液。

3.2 按照3M Petrｉｆilｍ （第二代)金黄色葡萄球菌快速检验测试片和确认反应

片的操作说明进行操作,并且判读结果。

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乳与乳制品病原微生物检验方法

金黄色葡萄球菌肠毒素的检验 YLNＢ4.２ 1. 仪器及器材

1.１德国必发葡萄球菌肠毒素试剂盒 （套） 1.２酶标仪

1.3移液器 Ｔｅrmo Lａbsystems 50 μL 、100μL 、300μＬ(多道) １．４低温离心机及离心管:3500转/分

1．５灭菌吸管：１ml（具0．01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度） 1．6 NaＨ2PO4。Ｈ2O、 Na2HPＯ4。2H2O、ＮaCI、 n--庚烷 2. 检验程序 :

将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架 样品前处理

，加100 µL加入100 µL样品(A---G孔)在H 孔中室温 ,１ h

ﻩ

反复洗板（至少３次） 加100 µL酶共轭化合物 室温， 1 ｈ 反复洗板（至少３次）

加５0 µL的培养基和５0 µL色液体 室温， 0．5 h

加100 µL终止液

60miｎ内

测量吸光度值

3. 方法 ３.1样品前处理

3.1.1 牛奶：取 10mｌ样品于离心管内进行低温离心（10miｎ／３50０转/10℃)后去除上层油脂层,取上清液1ml,按1：20的比例用蒸馏水稀释后无菌过滤。 3.1.2 面、米、肉、奶油及其他脂肪含量低于40%的食品:取1０ｇ样品切碎（最好进行均质),添加１5ｍＬ缓冲液，调节ＰH值至7．4,摇匀15min后进行离心(10miｎ/3500转/1５℃),如必要去除上层油脂层,过滤。

3.1.3 脂肪含量超过40%的食品：取10g样品切碎（最好进行均质），添加15mＬ缓冲液，调节PH值至7.4,摇匀15ｍin后进行离心(10min／350０转/1５℃)，取5mL上层液转移到另一个离心管内，加5mL的ｎ—庚烷，充分混匀后再离心(５min/35０0转／15℃）,去除上层庚烷层，过滤。 3.2测试操作

3.2.1 把所有试剂在使用之前均放至室温（20—25℃)。

分析结果出报告 ３.2.２ 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架上。

3．2．3 加入１00 µL样品（A-－-G孔),加100 µL阳性到Ｈ孔，用手轻轻摇动,在室温下避光培养1小时。

３. 2. 4 把孔中的液体倒掉,用多道移液器在每个孔中加入250 µＬ缓冲清洗液冲洗微孔(一排至少３次)，从而去除孔中残留的液体。

3. 2. 5 每个孔中加10０ µＬ酶共轭化合物,轻轻摇动，在室温下避光培养1小时。 3. 2. 6把孔中的液体倒掉，用多道移液器在每个孔中加入250 µL缓冲清洗液冲洗微孔（一排至少3次),从而去除孔中残留的液体

3. ２. 7 在每个孔中加５0 µＬ的培养基和50 µL色液体,轻轻摇动，在室温下避光培养半小时。

3. ２. 8 在每个孔中添加10０ µL终止液，摇匀后在４5０nｍ处测吸光值。 4. 结果分析

4.1阳性对照样的吸光值应该大于0.５个单位;阴性对照样的吸光值（位于F和Ｇ孔）应该等于或小于0.3个单位。如果试验结果不符合以上条件,说明试验失败,必须进行复检。 ４．2结果判定如下：

4.２．１ 取两个阴性对照样的吸光值的平均值+０.15为参照值。

4.2．２ 如果吸光值大于参照值可判为金黄色葡萄球菌肠毒素阳性，小于参考值可判为金黄色葡萄球菌肠毒素阴性。 ５． 注意事项

5.1试验过程中必须严格按照清洗步骤进行清洗。 ５．2培养过程中要避光。

5.3阳性对照样含有葡萄球状肠毒素，会对人体造成危害，避免直接接触皮肤。 5.４所有接触过阳性对照样的原料应小心处理，玻璃器皿的净化最好用１0%的次氯酸钠溶液浸泡。

5.5停止液内含有１N硫酸,避免直接接触皮肤。

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乳与乳制品病原微生物检验方法

沙门氏菌的检验 ＹLNB 4.3 方法一:国标法 1． 仪器及器材 １.１ 冰箱：0-4℃

１.2 恒温培养箱:３6℃±1℃ １.3 显微镜：1０×——100× 均质器或灭菌乳钵 天平：0-500g,精度0.５g

灭菌试管：10ｍｍ×100ｍm、１6mm×160ｍｍ

灭菌吸管:1mｌ（具0．０1ml刻度)、１0mｌ（具0．１ml刻度) 灭菌锥形瓶:500ｍｌ、10０ml

灭菌培养皿:直径90cｍ 灭菌小试管:3mm×50ｍm 灭菌毛细管。 ２. 培养基和试剂

２.1缓冲蛋白胨水(BP)：按GＢ ４７8９.28中4．１2规定。 2.2 氯化镁孔雀绿(MM）增菌液：按GB ４789．２8中4.13规定。 2.3 四硫酸钠煌绿(TTB)增菌液:按GＢ 4789.２8中4．14、4.１5规定。 2.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：按GB 47８9.2８中4.16规定。 2.5 亚硫酸铋琼脂(BS）:按ＧB 47８9.２8中４．19规定。 2.6 ＤＨL琼脂：按GＢ 4789.2８中４.20规定。 ２.7 HE琼脂：按GＢ ４78９.28中4．2１规定。 ２．8 WS琼脂:按GB 4７89.28中4.２３规定。 2．9 SＳ琼脂：按GB ４７89．28中4.22规定。

２.10 三糖铁琼脂：按GB 4７89.28中4.26，4.２７规定。 2．1１ 蛋白胨水、靛基质试剂:按GB 4７89.28中3.13规定。

２.12 尿素琼脂(pH7.2)：按GB 4７89.28中3.1５规定。2.13ﻫ 氰化钾（KＣN)培养基：按ＧB 47８9.28中3.16规定。

2.14 氨基酸脱羧酶试验培养基：按ＧB 478９.28中3.12规定。2.15ﻫ 糖发酵管:按GB 4７89.28中3.2规定。ﻫ２.1６ ONＰＧ培养基：按GＢ 4７89．2８中3．3规定。

2.1７ 半固体琼脂:按GB 4７89.２8中4.30规定。

2.18 丙二酸钠培养基：按GB ４７8９.28中３.7规定。2.19ﻫ 沙门氏菌因子血清：按26种用于初步分型;57种用于进一步分型；163种用。 3. 检验程序

检 样 前增菌法 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品 25g+BP 225ml 直接增菌法 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品 25g+灭菌生理盐水25ml,做成检样匀液 36℃±1℃ 一般4ｈ 干蛋品１8 ｈ—２4h 10ml+MMA (或TTB)100ml 10ml+SC100ml 检样匀液25ml+ MM（或TTB)100ml 检样匀液25ml+ SC 100ml 42℃ １8 h—２４h ３6℃±1℃ １8 h—24h 42℃ 18 ｈ—24h 36℃±１ 18—２4h

BS DHL(或HE、WS、SS) 36℃±1℃ 40h—4８ｈ 36℃±1℃40ｈ-48h 挑取可疑菌落 TSI(斜面、底层、产气、H2S),蛋白胨水（靛基质），尿素（PH7.2），KCN，赖氨酸 尿素ˉKCNˉ 沙门氏菌 血清学实验 赖氨酸+ H2S+ 靛基质ˉ H2S+ 靛基质+ 尿素ˉKCNˉ 赖氨酸+ H2Sˉ 靛基质ˉ 尿素ˉKCNˉ 赖氨酸+/- 非如左述的各种反应结果 甘露醇 ONPG 沙门氏菌 血清学实验 非沙门氏菌 非沙门氏菌 ４. 方法 4．1 前增菌和增菌

冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。各称取检样25g,加在装有２25ｍL缓冲蛋白陈水的５00ｍL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000～1００00ｒ／mｉn打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化,于36±1℃培养4h（干蛋品培养18～24h)，移取１０mＬ,转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内,于42℃培养18～24h。同时，另取1０mL,转种于100mL亚硒酸盐肮氨酸增菌液内，于36±1℃培养1８～2４h。ﻫ 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g(25mL)加入灭菌生理盐水２5mL，按前法做成检样匀液;取25mL，接种于１００ｍL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内,于４2℃培养24h；另取25mＬ接种于１00mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36±1℃培养18～２4h。ﻫ４．２ 分离ﻫ 取增菌液1环,划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DＨL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SＳ琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于３6±1℃分别培养18～２4h(ＤHL、ＨE、WS、SS)或40～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和沙门氏菌Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表1。

表1 沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征于详细分型。

报 告 选择性 琼脂平板 亚硫酸铋琼脂 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ （即亚利桑那菌） 产硫化氢菌落为黑色有金属光泽、黑色有金属光泽 棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢,形成灰绿色的菌落，周围培养基不变 DHＬ琼脂 无色半透明，产硫化氢菌落中心带乳糖迟缓阳性或阴性的菌黑色或几乎全黑色 株与沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖阳性的菌株为粉红色,带中心带黑色 HE、WS琼脂 蓝绿色或蓝色,多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色 乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎黑色;乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色,中心黑色或几乎全黑色 ＳＳ琼脂 无色半透明,产硫化氢菌株有的菌乳糖迟缓阳性或阴性的菌落中心带黑色，但不如以上培养基株,与沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、明显 Ⅴ、Ⅵ相同;乳糖阳性的菌株为粉红色，带中心带黑色，但中心无黑色形成时与大肠艾希氏菌不能区别 对可疑的菌落可挑取单菌落做沙门氏菌全套生化试验和血清学试验。 4.3 生化试验和血清学试验按照GB/T4789.4－２003进行。 5. 结果报告

如果在各种选择性培养基上无菌落生长,则报告“阴性”或“未检出”;如果有可疑菌落出现,可报告“有可疑菌落”或进一步做生化试验及血清学试验鉴定后报告“阴性”或“阳性”。 方法二：显色培养基法

１. 仪器及器材

1.1 恒温培养箱:３6±1℃ 1.2 水浴锅：４２±0.2℃

1.3 灭菌锥形瓶：３00mｌ、5０0ｍl 1.4 灭菌吸管：１ml、1０ml 1.5 灭菌培养皿:90mm 2． 培养基和试剂 2.1 缓冲蛋白胨水（BP): 蛋白胨 10g 氯化钠 5g

磷酸氢二钠（ＮaHPO4.1２H2Ｏ) 9g

磷酸二氢钠 １.５ｇ 蒸馏水 １0０0ml PH7.2

以每瓶22５mｌ分装于300ml锥形瓶中,121℃高压灭菌15ｍin备用。 2.2 RVＳ增菌肉汤: 2.3 沙门氏显色培养基: 2.4 营养琼脂:

2.5 全套生化试验和血清学试验试剂：见GB/T4789.4－2003 ３． 方法

3.1 以无菌操作取25ｇ(ml）,加在装有22５ml缓冲蛋白胨水的300mｌ锥形瓶中(有

玻璃珠数粒）,摇动数分钟,使样品完全溶解。

3.2 吸取1ｍｌ样品液加入９ｍlRVS肉汤中,在42±0.2℃的水浴锅或培养箱内,增

菌培养２４±２小时。

3.3 用3mm接种环取1环增菌液，划线接种到沙门氏显色培养基上,,做2个重复。 3.4 ３6±1℃培养2４-28小时,观察菌落形态。

3.5 沙门氏菌(伤寒沙门氏菌除外）显亮红色，大肠杆菌和大肠菌群显蓝色,枸

橼酸杆菌显紫色,其它细菌显黄色或无色。

3.6 对可疑的菌落可划线到营养琼脂平板上,３６±1℃培养1２-16小时,挑取单菌

落做沙门氏菌全套生化试验和血清学试验。

3.7 生化试验和血清学试验按照GB/Ｔ47８９．４-２0０3进行。 4. 结果报告

如果在沙门氏显色培养基上无菌落生长，则报告“阴性”或“未检出”；如果有可疑菌落出现,可报告“有可疑菌落”或进一步做生化试验及血清学试验鉴定后报告“阴性”或“阳性”

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乳与乳制品病原微生物检验方法

志贺氏菌的检验 YLNB 4.

４

１.仪器及器材

１.1 架盘药物天平:0——500g,精确至0.5g 1.２ 均质器或灭菌乳钵。

1．３ 恒温培养箱：36±１℃,４2℃ 1.4 冰箱

1.5 灭菌广口瓶:５００mL。 1.6 灭菌锥形瓶：50０ｍL，250mL。 1.7 灭菌平皿:直径90mm 1.8 显微镜：10×——100×。

１．9 硝酸纤维素滤膜：150mｍ×50mm, 0．45μm。临用时切成两张，每张７0mm

×50ｍm,

用铅笔划格,每格6mm×6mm。每行１0格,分6行。灭菌备用。 2． 培养基和试剂

2.１ ＣN增菌液:按ＧＢ 4７８9.28中4.1７规定。 2.2 HE琼脂:按GB 478９．２8中4.21规定。 2.３ SＳ琼脂:按ＧB 4７8９.28中4.22规定。 2．４ 麦康凯琼脂:按GＢ ４78９.28中4．24规定。 2.5 伊红美蓝琼脂(EMＢ）:按ＧB ４789.28中4.２５规定。 ２.6 三糖铁琼脂(ＴSＩ)：按GB ４789.28中4.26、４．２7规定。 ２．7 葡萄糖半固体管：按GB 478９．２8中4.31规定。 2.８ 半固体管：按GB 4７８9.2８中４.30规定。 2.9 葡萄糖铵琼脂:按GB ４789.2８中3.8规定。 2.10 尿素琼脂（pH7.2):按ＧＢ 4789.28中3．1５规定。 2.11 西蒙氏柠檬酸盐琼脂:按GＢ 4７８９．２8中3.5规定。 2.１２ 氰化钾(KCN)培养基:按GＢ 4789.28中3.16规定。

２.13 氨基酸脱羧酶试验培养基：赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基,按GＢ ４789.28中３．1２规定。

２.14 糖发酵管:棉子糖、甘露醇、甘油、七叶苷及水杨苷,按GＢ 47８9．２8中3．2规定。

2.15 5%乳糖发酵管:按ＧB 47８9．２８中4.3２规定。

2．1６ 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 47８9.２8中3.13规定。 2．1７ 志贺氏菌属诊断血清。 ３． 检验程序

志贺氏菌检验程序如下:

25g+GN225ml 检 样 36℃±１℃,６-８h HE琼脂或SS EME 36℃±１℃,１麦康凯或8-24h TSI底层产酸，斜面产碱,H2S－ ４．方法 4.1 增菌

称取检样25g,加入装有225ｍＬGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8 000～10 ０00r／min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用金属匙或玻璃棒

报 告 非志贺氏菌 志贺氏菌 分群及分型结果 葡萄糖铵＋或任何其他阳性结果 非志贺氏菌 生化分群试验 葡萄糖铵试验、西蒙氏柠檬盐 赖氨酸,尿素,KCN水扬苷和七叶苷 血清学分析 进一步的生化试验 不产气，无动力 如左述的各种发应结果 TSI，葡萄糖半固体 挑取可疑菌落 研磨使其乳化,于3６℃培养6~8ｈ。培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。 4．２ 分离和初步生化试验

4.2.1 取增菌液1环,划线接种于HＥ琼脂平板或SS琼脂平板1个;另取１环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个，于36℃培养１８~24h,志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

4．2．２ 挑取平板上的可疑菌落,接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各１管。一般应多挑

几个菌落,以防遗漏,经3６℃培养1８～24ｈ，分别观察结果。 ４．２.3 下述培养物可以弃去：

a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物; b. 在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物； c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物； ｄ. 产气的培养物; e． 有动力的培养物; Ｆ. 产生硫化氢的培养物.

4．２．4 凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌６型可产生少量气体）,

无动力的菌株,可做血清学分型和进一步的生化试验。

4．2.5 生化试验和血清学试验按照ＧB／Ｔ４789.5-20０3进行。 5. 结果报告

如果在培养基上无菌落生长，则报告“阴性”或“未检出”;如果有可疑菌落出现，可报告“有可疑菌落”或进一步做生化试验及血清学试验鉴定后报告“阴性”或“阳性”

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乳与乳制品病原微生物检验方法

溶血性链球菌的检验

YLNB4．5

１．仪器及器材

１.１ 恒温培养箱：36±1℃。

1.2 恒温水浴锅:36±1℃。1ﻫ.３ 显微镜。

1.４ 离心机：4000 r／mｉnﻫ１.５ 均质器或灭菌乳钵。

1.6 灭菌平皿:直径90ｍｍ。1ﻫ．７ 灭菌试管:10mｍ×10０mm 、16mｍ×16０mｍ

1.８ 灭菌吸管：１mL、5ｍL 、10mL。 1．9 冰箱：0~４℃

1.10 灭菌锥形瓶:1０0ｍL。1.11ﻫ 架盘药物天平:0g~50０g,精确至０.5g。

ﻫ1.12 灭菌棉签、镊子等。

2. 培养基和试剂2ﻫ．1 葡萄糖肉浸液肉汤:按GB ４789.２8中4.1规定，在肉浸液肉汤内加入1％葡萄糖。

2．２ 肉浸液肉汤:按GB 4７89．28中4.1规定。ﻫ２.3 匹克氏肉汤:按GＢ 4789．2８中4．62规定。ﻫ２.4 血琼脂平板：按GB ４789.２8中４．６规定。 2.５ 人血浆。

2.６ 0.25%氯化钙。2.7ﻫ 灭菌生理盐水。 ２．8 杆菌肽药敏纸片(含0.0４单位)。 3. 检验程序

葡萄糖肉浸液肉汤 或匹克氏肉汤 检 样 25g(ml)+225ml灭菌生理盐水 3６±1℃ ２4h 血 平 板 36±1℃ ２４h

3６±１℃ 2４h

报 告 链激酶试验 杆菌肽敏感试验 观 察 溶 血 革兰氏染色 血平板（分纯培养） 4. 方法ﻫ４.1 样品处理ﻫ 按无菌操作称取食品检样２５g (mＬ），加入２25ｍL灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。

4.２ 培养

将上述混悬液吸取5mL,接种于5０ｍＬ葡萄糖肉浸液肉汤；或直接划线接种于血平板,如检样污染严重,可同时按上述量接种匹克氏肉汤,经３6±1℃培养24h,接种血平板,置36±１℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。ﻫ4.3 形态与染色

本菌呈球形或卵圆形，直径0.5~1μm，链状排列,链长短不一,短者4～8个细胞组成,长者20~3０个,链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链;在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛,不能运动。4.4ﻫ 培养特性

该菌营养要求较高,在普通培养基上生长不良,在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑,有乳光，直径约0.５~0.7５mm,为圆形突起的细小菌落,乙型溶血链球菌周围有2~4mｍ界限分明、无色透明的溶血圈。 ４．5 链激酶试验

致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶）,此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原,使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。ﻫ 吸取草酸钾血浆０.2ｍL，加0.８ｍL灭菌生理盐水，混匀,再加入18～2４h36±１℃培养的链球菌培养物0.5ｍL及0.25%氯化钙0.２5mＬ(如氯化钙已潮解,可适当加大至０.3％～0.35%)，振荡摇匀，置于３6±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置，内容物不流动)。然后观察凝块重新完全溶解的时间,完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。ﻫ 草酸钾人血浆配制：草酸钾0.0１g放入灭菌小试管中，再加入5mL人血,混匀,经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。ﻫ４.6 杆菌肤敏感试验

挑取乙型溶血性链球菌液,涂布于血平板上,用灭菌镊子夹取每片含有０.０4单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上,于36±1℃培养1８～2４h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。

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乳与乳制品病原微生物检验方法

单增李斯特菌的检验 YＬNB 4.６

1． 仪器及器材

１．1 恒温培养箱：３0±1℃、２4±１℃

１.2 恒温水浴锅：4６±１℃。1ﻫ．3 显微镜:10×~１0０×1.4ﻫ 离心机：40０0 r／min

1.5 均质器或灭菌乳钵。

1.6 灭菌平皿:直径90mm。1ﻫ．7 灭菌试管： 16ｍm×16０ｍmﻫ１.８ 灭菌吸管:1mL(具有0．0１mL刻度)、1０mL（具有0.1ｍL刻度)。 1.9 冰箱：0－４℃

１．10 锥形瓶：1０0mL、５00ｍＬ。

１．11 架盘药物天平:0g~500ｇ,精确至0.5ｇ。 1.12 离心管：３0mm×300mm。

1.13 灭菌注射器:１ﻫ１.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。 1．1５ 马红球菌。 1.１6 小白鼠:1６g~18g。 2. 培养基和试剂

2.1 含0.6％酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A１。

2.2 含０．6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSＡ-ＹE)：见附录A2。 2.3 EB增菌液：见附录Ａ3。

2.４ LB增菌液（LB1，LＢ2):见附录A4。2ﻫ.５ 三糖铁(TＳI)琼脂:GB／Ｔ4789．2８中4.２6,4.２７。

2.６ SIM动力培养基：见附录A5。2ﻫ．7 血琼脂:ＧB/Ｔ４78９.2８中4.6。2.8ﻫ 改良的Mc Brｉdｅ（MMＡ)琼脂：见附录A5。

２．9 硝酸盐培养基：GB／Ｔ 4789.２8中3.1７。ﻫ２.１0 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用):ＧB/T4789．28中３.４。2ﻫ.１1 糖发酵培养基：GB/Ｔ47８9．2８中3.２。2.12ﻫ 过氧化氢酶试验:ＧB/T4789.2８中4.38。 2.１3 盐酸吖啶黄(AcｒiｆlaｖineＨCｌ)（Sigｍa)。

2.１4 萘啶酮酸钠盐（Naｌａdiｘｉcaｃid）（Ｓｉｇma)。3ﻫ. 检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下:

EB增菌液225ml LB1增菌液225ml 检样25g(ml) 3030℃,24h

℃,48h

LB2增菌液225ml 30℃，24h

选择性培养基(MMA) 30℃,２４～48h

SIM动力培养基 TSI琼脂 2３0℃,２４ｈ

５℃ ２ｄ～5d(伞状)

TSA-YE培养基 30℃,２4h MR-VPﻫ4． 方法4.1ﻫ 样品的收集及处理ﻫ 无菌取样品2５g(mL）放灭菌均质器中加2２5mLＥＢ和LB增菌液中,充分搅拌成均质。如不能及时检验,可暂存4℃冰箱。 4.2 增菌培养

EB增菌液放３0±1℃培养48h，LB１增菌液225mL放30±1℃，培养24h，吸取０．1ｍＬ,加入1０mL LB２增菌液中二次增菌。

4.3 分离培养ﻫ 将EB增菌液和LB2二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上,培养3０±１℃ 4８h,挑选可疑菌落,用白炽灯45°角斜光照射平板,李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。ﻫ４.4 选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TＳI）琼脂和ＳIM动力培养基，培养于2５±1℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察2~7ｄ,阳性者可做下一步鉴定。 ４．5 纯培养

将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA－YE)上,做纯培养供做以下鉴定。4.6ﻫ 染色镜检ﻫ 将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.４～0.５μm×0.5~2.0μｍ;用生理盐水制成菌悬液,在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。4ﻫ．7 生化特性

将上述可疑菌做进一步的生化试验,单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见表1。

表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别

革显兰 微氏镜染 下色观 察运动实验硝酸盐还原实验过氧化氢酶实验甘露醇木醇鼠李糖七叶苷溶血实验协同溶血实验小鼠致病力实验 菌种 溶血反应 硝酸盐还原 尿素酶 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷 单核细胞增生李斯特氏菌 + 绵羊李斯特氏菌 + － - +／+ - + - ＋ - － +／+ - - － + 英诺克李斯特氏菌 － - - +／＋ － Ｖ － + 威尔斯李斯特氏菌 - - - +/＋ - V + + 西尔李斯特氏菌 + - - ＋/＋ - - + + 格式李斯特氏菌 - - - +/+ + - - ＋ 默氏李斯特氏菌 － + - +/+ + V - + 注：V反应不定；＋阳性；-阴性。 4．8 对小鼠的致病力试验

将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中,在３0℃培养24h，离心，浓缩,使浓缩液每毫升10１0/mL个细菌，取0.5mＬ浓缩菌液注射小白鼠腹腔,3~５只,观察小鼠死亡情况。致病株于2~5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。

4.9 协同溶血试验(cＡMP）ﻫ 在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌(R．eｑui），在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及它们,在30℃培养２4～48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强,而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。

附录Aﻫ 培养基ﻫ （补充件)

Ａ1 含０.6%酵母漫膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB－YＥ)ﻫ A1.1 成分ﻫ 胰胨 17ｇ

多价胨 ３gﻫ 酵母膏 6gﻫ 氯化钠 5ｇ

磷酸氢二钾 ２.5gﻫ 葡萄糖 ２.5g 蒸馏水 100０mL

A1.2 制法ﻫ 将上述各成分加热搅拌溶解,调至pH7.2～7.4，分装,1２1℃灭菌1５ｍin,备用。ﻫ Ａ2 含0.6%酵母膏胰酪胨大豆琼脂(TSA－YE) A2.１ 成分

胰胨 １7gﻫ 多价胨 3ｇﻫ 酵母膏 6g

氯化钠 5g 磷酸氢二钾 2.5g

葡萄糖 2.5gﻫ 琼脂 1５g

蒸馏水 １０00mLﻫ A２.2 制法ﻫ 将上述各成分加热搅拌溶解,调pＨ至７.２~7.4,分装，121℃高压灭菌，备用。ﻫ A3 EB增菌液ﻫ A3.１ 成

分ﻫ 胰胨 17ｇﻫ 多价胨 ３gﻫ 酵母膏

6gﻫ 氯化钠 5gﻫ 磷酸氢二钾 2.5gﻫ 葡萄糖 2．5ｇﻫ 蒸馏水 １000mL

盐酸吖啶黄 15mg/Lﻫ 萘啶酮酸 40mｇ／Ｌ A3.2 制法

除吖啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合调ｐH至7.２～7.4，121℃15ｍiｎ高

压灭菌。使用前加吖啶黄溶液1５mg/Ｌ和萘啶酮酸溶液40mg/L,此两种成分要无菌配制或过滤除菌。ﻫ Ａ4 李氏增菌肉汤（LB1,LＢ2)ﻫ A4.1 成分 胰胨 ５gﻫ 多价胨 5g 酵母膏 5gﻫ 氯化钠 5g 磷酸二氢钾 1.35ｇ 磷酸氢二钠 1２g

七叶苷 1gﻫ 蒸馏水 10０0ｍLﻫ A4.2 制法ﻫ 将上述成分加热溶解，调pH至7.2~７.4，分装，121℃15mｉｎ高压灭菌。 A4．2.1 李氏Ｉ液(LB1)225ｍＬ中加入:ﻫ 1％萘啶酮酸（用０.05ｍoｌ/L氢氧化钠溶液配制) 0.4５ｍL

1%吖啶黄(用灭菌蒸馏水配制） 0.27mLﻫ A4.2.2 李氏Ⅱ液(LＢ

２

)2０0mL中加入：ﻫ 1%萘啶酮酸 0．４0ｍLﻫ １%吖啶黄 0.５0mL

无菌分装于１0mL大试管中。ﻫ A5 改良的Mｃ Ｂridｅ琼脂（ＭMA)ﻫ A5.1 成分ﻫ 胰胨 5g 多价胨 5g

牛肉膏 3gﻫ 葡萄糖 １ｇﻫ 氯化钠 5gﻫ 磷酸氢二钠 １gﻫ 苯乙醇 2．5ｍL 无水甘氨酸 1０g

氯化锂 0．５gﻫ 琼脂 15g 蒸馏水 1０00mLﻫ A5.2 制法

将上述成分加热搅拌混匀，调pＨ至７.2~７.４，分装,1２１℃ １５min高压灭菌,备用。

A6 SIＭ动力培养基 A6.1 成分

胰胨 20g

多价胨 6ｇ ﻫ 硫酸铁铵 ０.2gﻫ 硫代硫酸钠 0．２g 琼脂 3.5g

蒸馏水 1０00ｍLﻫ A6.2 制法ﻫ 将上述各成分加热混匀,调

pH7.2,分装小试管,高压灭菌121℃ １5ｍin。

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乳与乳制品病原微生物检验方法

奶粉阪崎肠杆菌的检验 YLＮＢ 4.7

1. 仪器及器材

1.1 水浴锅:循环系统使温度保持在45.5±0.2℃。水的高度应高于浸入试管 的中部。

1.2 浸入式温度计：1－55℃,长度大约是5５ ｃm，精确度为０.1℃。 1.3 培养箱：３5－37°C和 24-2６°C。 1.4 吸管:1、5和1０ ｍｌ，精确度为0．1 ml。

1.5 L玻璃棒(如曲棍球棒状):直径为3-４ ｍm.,可涉及45-55 mm的区域。 1.6 接种环：环的直径为3 mｍ。

1.7 天平:量程为２ kｇ、精确度为０．1g。 1.8 灭菌样品处理器具:取样勺，剪刀,开罐器

1.9 样品稀释瓶:规格为100ml、125 ml、 160 ｍl、２5０ ml、２L 1.1０ 菌落计数器:或是其类似物,带有放大镜。 １.１１ API ２0E生化鉴别系统。

1.12 灭菌平皿：１5 x １50 mm或直径90ｍm。 1.1３ VITEK生化鉴定系统或类似设备。 ２． 培养基和试剂

2.1胰蛋白大豆琼脂(TＳA)：准备好的中间体可在２-8°C条件下贮存4周以 上。

2.2 紫罗兰红胆盐葡萄糖琼脂（VRBＧ琼脂）:加该成分至１升蒸馏水中，(加 经过滤过的浓度为１%染液）,加热到沸腾并搅拌直到所有成分溶解为止。对该中间体不必进一步消毒。冷却到45°C并倒入平皿中,平皿的直径最好为１5 ｃm。如果不是立即使用,贮存琼脂在5-8 °C。这个中间体在脱水情况下可

以商业形式应用（Oxoid, ＣM０４85);可在容器中直接激活使用。准备好的中间体可在２-８°C条件下贮存4周以上。

酵母粉 蛋白胨 氯化钠 No． 3胆盐

乳糖 中性红 紫罗兰结晶物

琼脂 葡萄糖

3．0 ｇ 7．0 g 5.０ g １．5 g 10.0 g ０.03 g ０.０0２ g 15．０ ｇ 10.0g

2.3 ＥE肉汤:加入干净的公牛胆汁和亮绿防止对数量不多活力不强的肠细菌

细胞造成抑制。溶解该成分在1升蒸馏水中,加热到沸腾,然后分成90 ml的体积。这个中间体在脱水情况下可以商业形式应用(Ｏｘoｉd, CM0317); 可在容器中直接激活使用。准备好的中间体可在２-8°C条件下贮存4周以上。

蛋白胨 葡萄糖

磷酸氢二钠二水化合物

磷酸二氢钾 公牛胆汁 亮绿

2．４ 氧化酶测试试剂： 3． 方法： 3.1 检验程序:

10．0 g ５.０ g 8.０g 2.0 g ２0.0 ｇ 0.015 ｇ

ﻩ

36±１℃ 18-22h

ﻩ 36±１℃ １8－２2h

ﻩ 36±1℃ 18-２２hﻩ或 ﻩ

ﻩ 25±1℃ 48－７2h3ﻩﻩ６±1℃ 18-２２h

３.2检验步骤

３.2.1取样前消毒样品包装的开启处和取样勺。无菌称取样品10０g至２L的样

报告 革兰氏染色 氧化酶试验 API 20E生化鉴定试剂盒、VITEK生化鉴定系统或其他 TSA平板 显色培养基（Xa-GlcA）平板 VRBGA 10ml加入90ml肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤） 样品100g加入900ml无菌蒸馏水 品稀释瓶中，加入900ｍl预热到４5℃的灭菌蒸馏水,或者将样品直接称量到装有9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水的样品稀释瓶中，振摇使样品充分混匀,36±１℃培养18-22h。

3.2．2 移取培养18-2２h的悬液10ml，加入90ｍlEＥ肉汤中，36±1℃培养18-２2h。

３.3.３轻轻混匀增菌液，用直接划线法进行平板接种:每份增菌液用３mｍ接种环 （１０ｕl）分别接种２个VRBGA平板或2个Xa-GlcA平板,三区法或四区法划线, 以得到单个菌落。将平板置36±１℃培养１８-22h。 3.３．4 观察平板上阪崎肠杆菌的典型形态：

在VRBＧA平板上:紫色菌落周围有一圈紫色的胆汁酸沉淀环，圆形,凸起, 直径2mm-３mm。

（图片来源于Sｈａrｏn Edelsｏn Mammｅｌ)

在Xa-GｌcA平板上：蓝绿色菌落,圆形,直径1ｍｍ－2mm。

3.3．5 在VRBＧA平板上挑取５个可疑菌落分别接种到5个ＴSA平板，25±1℃ 48-72h 。

典型菌落是黄色的（图片来源于Shaｒon Edelson Mammｅl)

3.３.6 从Xａ-GlcA平板挑取5个可疑菌落，革兰氏染色,做氧化酶试验。革兰氏 染色阴性,氧化酶阴性,应用API 20E生化鉴定试剂盒或VITEＫ生化鉴定系统进 行生化鉴定。

３.３.7 从ＴSA平板上挑取黄色菌落,革兰氏染色,做氧化酶试验。革兰氏染色阴 性，氧化酶试验阴性,应用API 20E生化鉴定试剂盒、VITEK生化鉴定系统或其 他细菌鉴定系统进行鉴定。 3.3.8 肠杆菌属细菌生化特性：

生化特性 阪崎肠试验 杆菌 E. sａkazaｋｉｉ 阴沟肠杆菌 E． ｃloaｃａｅ - + 产气肠杆菌 聚团肠杆菌 E. aｅＥ． aggｌoｒogｅnes + - - － 葛高菲肠杆菌 E． geｒｇoｖｉae + - ｍeraｎs 赖氨酸脱羧酶 精氨酸脱氢酶 - + 鸟氨酸脱羧酶 ＫCN, 生长中 蔗糖 己六醇 核糖醇 发酵物 棉子糖 D-山梨醇 ｘ－甲基-D-苷 D-阿拉伯糖醇 黄色素 ａ＋ + + - - + - + - + + ＋ ＋ （－） (-) ＋ ＋ (＋） (-) - + ＋ + - + + + - + － － v （+) (-) － v v - - (+) ＋ - + - - + - － + - Ａdａptｅd ｆｒom Farmer and Kｅlly, １9９２.ﻫb ＋代表 ９0-100% 阳性; （+） : ７５-89%阳性; v: ２5－74%阳性； (－): 10-２4%阳性; －: 0-9%阳性 E. aeroｇenes肠道产气菌 3.3.９根据检验结果，报告每100g样品中是否检出阪崎肠杆菌。

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乳与乳制品病原微生物检验方法

粪链球菌群的检测 YLNB

4.8

1. 仪器及器材 １.1 培养箱：36±１℃ 1.2 冰箱：0~4℃ 1．3 恒温水浴：46±1℃ １．4 天平 1.５ 电炉 1．6 吸管

1.7 广口瓶或三角瓶:容量为500ml 1.8 玻璃珠：直径5mm 1.9 平皿：直径约９0mm １.１０ 试管 1.11 放大镜 １.１2 菌落计数器 １．１3 酒精灯 1.14 均质器或乳钵 １.15 试管架 １.16 灭菌刀或剪子 1.17 灭菌镊子 ２. 培养基和试剂

2.1:pfrzｉr肠球菌选择性培养基(ＰＳＥ)：按SＮ/T0４７5-95中规定或按购买的商用培养基配方配制。

2．2 :KF链球菌琼脂:按SN／Ｔ０475－95中规定或按购买的商用培养基配方配制。

2.3：叠氮化钠葡萄糖肉汤:按SN／T0４75-95中规定或按购买的商用培养基配方

配制。 2.4:生理盐水 ２.5:75%乙醇溶液 ３． 检验程序

方法一：平板计数法：粪链球菌的检验程序如下:

检样 做成几个适当倍数的稀释液 选择2-3个适宜稀释度各以1ml分别加入灭菌平皿中 每个皿内加入适量KF琼脂(或PSE琼脂) ３6±1℃ 48±2h(或24±2h)

菌落计数 报 告 3.１ 操作步骤

3．1.１ 检样稀释及培养

3.1.１.１ 以无菌操作将检样２5g（或ml）剪碎放于装有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内,(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后,最好置均质器中以８000~10000r/min的速度处理1min，做成１：10的均匀稀释液。

３.1.1．2 用1ml灭菌吸管吸取１：１0稀释液１ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)振摇试管，混合均匀,做成1：100的稀释液。

3．1.1.3 另取1ml灭菌吸管,按上述操作顺序,做10倍递增稀释液,如此每递增稀释一次，即换用一支１ｍl灭菌吸管。

３.1.1.４ 根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择２-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内。

３．１.1.5 稀释液移入平皿后,应及时将凉至４6℃的pfrzir肠球菌选择性培养基或kf链球菌培养基(可放置于46±1℃水浴中保温）注入平皿约１５mｌ,并转动平皿使混合均匀。同时将培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内做空白对照。 ３.1.1．6 待琼脂凝固后，翻转平板,置36±1℃培养箱内培养4８±２h（2４±12ｈ)。

3.１.2 菌落计数方法

做平板菌落计数时,可用肉眼观察，必要时用放大镜,以防遗漏。在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落总数。粪链球菌在KF平板上形成暗红色至粉红色菌落,边缘整齐，琼脂表面下菌落呈椭圆或晶体状;在ＰＳE平板上形成带棕色环的棕黑色菌落。选择有30－300个菌落的平板进行计数（菌落计数的报告按照GB/T4789.2的相关条例），按粪链球菌数/g(mL)报告结果。 方法二:多管法： 4.1检验程序:

检 样

稀 释

叠氮化钠葡萄糖肉汤管 36±1℃，24±2h

不混浊 混浊 混浊不明显

粪链球菌阴性 PSE平板 继续培养至 36±1℃，24 ±2h 48 ± 2h

报 告

是否带棕色环的棕 黑色菌落

是 否

粪链球菌阳性

粪链球菌阴性

报 告

4.2 方法

4.2.１ 检样稀释(同方法一）

４.2．２ 接种培养:

选适当稀释液的样液接种一套叠氮化钠肉汤管，接种量在１ml或1mｌ以下者 用10ml单料管，接种量为10ｍl者用10ml双料管。每一稀释度接种3管，置36 ±1℃培养箱内,培养24±2h，检查各试管的混浊情况,如果所有试管不混浊, 则可报告为粪链球菌阴性，如果有混浊情况，按下列程序进行。（若混浊不明显继

续培养至4８±2h后记录结果。) 4.2.３ 确证试验：

培养24±2h或48±2h之后，对所有产生混浊的试管进行确证试验，用接种环将各管的培养物划线于PSE平板上,36±1℃培养24±2h,在平板上出现的带棕色环的棕黑色菌落,确证为粪链球菌群细菌。 4.２．4 报告

根据证实为粪链球菌阳性的管数查MPＮ检索表,报告每1mｌ(g）粪链球菌群的最可能数。

MＰＮ检索表见附录。

附录:１g样品中最可能数(MPN)表

阳性管数 ０.１mｌ 0.０１ｍl 0 0 0 0 0 ０ 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 １ 2 2 2 ２ ２ 2 2 ２ 2 ２ 2 2 2 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 ２ 2 ２ 3 ３ 3 3 ０ ０ ０ 0 1 １ 1 1 2 2 ２ 2 3 3 0.０01ｍl 0 2 2 ３ 0 1 2 3 0 １ 2 3 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 ３ 0 3 MＰN ≤3 6 6 9 ３ ６.1 9.2 １2 6.2 9.３ 1２ 16 ２0 24 16 20 24 29 9.１ １4 2０ 2６ 15 2０ 27 ３4 21 28 35 42 29 ﹥1100 0.1ml 0 ０ ０ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 ３ 3 3 3 3 阳性管数 0.０１ml 0.0０1ｍl 3 3 3 ０ 0 0 1 1 1 1 1 2 2 3 3 3 ０ 0 ０ 0 1 1 １ 1 ２ 2 2 2 3 3 3 １ 2 3 0 1 2 2 0 １ 2 3 ０ 1 1 2 3 0 1 2 3 ０ 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 MPN １3 16 19 3．6 7.2 11 １5 ７.3 11 15 19 11 １5 36 44 ５3 23 39 ６４ 95 ４3 75 １2０ 16０ 9３ 15０ ２1０ 290 2４０ ４60 １100 注：表内所列样品量如改为1，0.１，0.01g（mｌ）时，表内数字应相应降低10倍；如改为

0.01,0.0０1,０.00０1 g（ml)时,则表内数字相应增加1０倍,其余可类推。

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附图１ 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片

金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛,大多数无荚膜。

革兰氏染色阳性。

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附图２ 金黄色葡萄球菌的平板菌落照片

金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好,需氧或兼性厌氧，最适生长温度３７°C,最适生长ｐH 7.4。

平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起,直径1-2mｍ。血平板菌落周围形成透明的溶血环。

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附图3 金黄色葡萄球菌在ＢP平板上的菌落形态

金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baｉrｄ-Parｋer琼脂平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿 润，直径2～3mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈 （沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分 解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱 水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙，质地较干燥。

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附图４ 志贺氏菌落在ＳＳ平板上的照片

大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌

是沙门氏菌。有黑色中心。 如果没有黑色中心,就很可能是志贺氏菌

了。

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附图5 大肠杆菌革兰氏染色照片

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乳与乳制品非常规理化指标检验

乳与乳制品中黄曲霉毒素M1的检测 YLNB5.１

方法:酶联免疫方法 1． 仪器及器材 1.1 冰箱：0－4℃

1.2 恒温摇床：2０-25℃ １．3 天平：精度0.1 g

1.4 高速低温离心机：4℃，离心力3500g 1.5 酶标仪:内置450 nm滤光片 1．6 酸度计:（pH７－9） 1.7 针式打印机

1.8 移液器:50 μL，1０0 μL,3００ μＬ(多道)，1000 μL 1.9 吸头:5０ μＬ，100 μL，3００ μL,1000 μL １.10 吸水滤纸：直径：１1cm 1.１1 离心管：1.5 mL， 3０ mＬ 1.1２ 容量瓶：50 mL ,10０ mL若干 １.13 烧杯：1０00 mL 1个，80 mL若干 １.1４ 玻璃棒：若干 １.１5 口罩:若干

1.16 一次性橡胶手套：若干 ２. 试剂

2.1 黄曲霉毒素M1测定试剂盒:按说明储藏 2.2 甲醇 分析纯

2．3 安替福民(有效氯大于10 %)：分析纯 2.4 去离子水 3. 方法 3.１ 样品前处理

鲜奶与液态奶:取１0 mL的样品→ 离心力35０0 g,离心15 min，温度4℃ → 取乳清测定。

奶粉：取6．25 g奶粉用６０℃的温水溶解并定容于５0 mＬ容量瓶中，后处理同鲜奶。

干酪：按试剂盒说明操作。

3.2 操作步骤：按试剂盒提供的操作说明进行。

３.3 实验过程中所有接触过黄曲霉毒素标准物品（包括废弃物与废水)，都要经过pH = 7．0, 10 ％的次氯酸钠溶液浸泡过夜,作无害化处理。反应停止液为1ｍｏl/L 硫酸，避免接触皮肤。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

食品及饲料中黄曲霉毒素B１的检测 YＬＮB 5.２

酶联免疫法 1． 仪器及器材

1.1 恒温摇床:２0-25℃ 1.２ 天平:精度０．１ ｇ 1.3 混匀器

1.4 酶标仪：内置４50 nm滤光片 1.5 针式打印机 １.6 小型粉碎机 １.7 酸度计：（pＨ7-9)

1.8 移液器：50 μL，１00 μL，300 μL(多道),1000 μL １.9 吸头:５0 μL,100 μL，300 μL,1000 μＬ 1.10 快速定性滤纸：直径:10 cm ，11ｃm １．1１ 漏斗 1.12 研钵

１.13 具塞锥形瓶 １5０ mL若干 1.1４ 烧杯:1000 mL １个 1.1５ 冰箱：0-4℃ ２. 试剂

２.１ 黄曲霉毒素Ｂ1测定试剂盒：按说明储藏 2．2 甲醇:分析纯

２.3 安替福民（有效氯大于1０ %)：分析纯 ２.4 去离子水 3. 方法

3.1 样品前处理：

样品粉碎后称取５．0 ｇ,加入具塞锥形瓶中,准确加入2５.０mL甲醇－水

（70＋30）溶液，盖塞后封严,强力振荡3 ｍin。用快速定性滤纸过滤，取１ mL 滤液,用１ ｍL 蒸馏水稀释，取50 μL 稀释液进行分析。 3.2 操作步骤:按试剂盒提供的操作说明进行。

3.3 实验过程中所有接触过黄曲霉毒素标准物品(包括废弃物与废水),都要经过pH ＝ 7．０, 10 %（v/v)的次氯酸钠溶液浸泡过夜，作无害化处理。反应停止液为1mol／Ｌ 硫酸，避免接触皮肤。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

常规法维生素C的检测 ＹLＮB ５.３ 1．范围

本方法适用于预混料、婴幼儿食品及乳粉中维生素C的测定。 2. 原理

用２，6-二氯靛酚钠标准溶液滴定抗坏血酸的方法。 ３. 试剂

3.1 4%的偏磷酸溶液;

3.2 维生素Ｃ标准溶液:0.0１mg/ml;(应现用现配） 3.3 0.04g/L的二氯靛酚钠溶液. (应现用现配） 4. 方法

4．1 样品处理：

ａ. 精密称取乳粉样品4g,置于50ml的容量瓶中,加入4%的偏磷酸溶液至刻度,

振荡5miｎ，过滤,滤液备用.

b.精密称取原料样品０．1g稀释１000倍，过滤。 4.2 测定：

吸取10ml滤液，用0.04g/L的二氯靛酚钠溶液滴定至溶液显粉红 色,30秒不褪色即可.

4.3 0.０1ｍg/ml标准维生素C溶液的滴定：要求该溶液现用现配。 从标准液中吸取10ml,用0.０4g/Ｌ的二氯靛酚钠溶液滴定至溶液显粉红 色,30秒不褪色即可,此结果作为对照样品消耗0．04g/L的二氯靛酚钠溶液的体 积。

5. 结果计算VCmg/100g其中：

Cb-－-标准Vc的实际浓度(即实际称取Vｃ的质量除以定容的体积），mg/mＬ;

CbDV100

VbmD---样品稀释定容后的总体积，mL;

Vb-－-滴定标准溶液时消耗０．0４ｇ／L的二氯靛酚钠溶液的体积mL； ｍ-－-精密称取样品的质量，g;

Ｖ-－－样品滴定时消耗的0．0４g/L的二氯靛酚钠溶液的体积；

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乳与乳制品非常规理化指标检验

ＹLNB ５.4

１.依据 ＧＢ／T 5４13.１8—１99７ ２.范围

本方法规定了用荧光法测定维生素C的方法。

本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素C的测定。 3. 方法提要

抗坏血酸（维生素C）在活性炭存在下可氧化成脱氢抗坏血酸，它与邻苯二胺反应生成一荧光团,该荧光团在约３50nm处有最大激发波长，而在约43０nm处荧光最强,荧光强度与浓度成正比。 加入邻苯二胺以前,使抗坏血酸形成HBO3-脱氢抗坏血酸络合物，可阻止其形成荧光产物,任何残留的荧光均由外来物引起,可将它们作为“空白”。 比较经相同氧化处理的样品和标样的荧光强度可计算出抗坏血酸的含量。 4． 试剂、菌种和培养基

所有试剂,如未注明规格,均指分析纯;所有实验用水,如未注明其他要求,均指三级水。

4．1 高峰氏淀粉酶(Tａka-Dｉsataｓe）。

4．2 偏磷酸-乙酸溶液:称取1５g偏磷酸及40mL乙酸于200mL水中，溶解后稀释至500ｍL备用。

4．3 酸性活性炭:称取２00g活性炭（化学纯）,加入1L体积为１：９的盐酸,加热至沸腾,真空过滤,取下结块于一个大烧杯中，加入１L水,搅拌过滤后，再用水清洗一次，在１１0～１2０℃烘箱中干燥过夜后使用。

４．4 乙酸钠溶液：用水溶解5０0g三水乙酸钠，并稀释至１Ｌ。

4．5 硼酸-乙酸钠：称取3ｇ硼酸，用乙酸钠溶液(3.４)溶解并稀释至１00mL，使用前现配。

4.6 邻苯二胺溶液:质量浓度200ｍg/Ｌ。称取2０ｍｇ邻苯二胺,用水稀释至100mL，

维生素C的检测

现用现配。

4．7 维生素C标准溶液:浓度100μｇ/mL。称取０.05０0g抗坏血酸，用偏磷酸-乙酸溶液（3．2）溶解并稀释至５０ｍL，取10mL该溶液用偏磷酸-乙酸溶液(3.2） 稀释至１00mL，制成标准溶液。现用现配。 5. 仪器 :荧光分光光度计。 ６. 方法 6．１ 样品处理

6．1.1 含淀粉的样品 准确称取5ｇ样品于1５0mL三角瓶中,加入０．5g高峰氏淀粉酶(3.1),再加入15mL45~5０℃的蒸馏水,混合均匀后,用氮气排除瓶中空气,盖上瓶塞，至45℃烘箱内30min,取出冷却至室温，用偏磷酸-乙酸溶液（3.２)转至100mL容量瓶内,定容。

6.１.2 不含淀粉的样品 准确称取2.5ｇ样品,用偏磷酸-乙酸溶液（３．2)溶解,定容至50mL。 6.2 测定

6.２．１ 将上述样液转至放有约1ｇ酸性活性炭(3．3)的25０ｍL三角瓶中，剧烈振动，过滤,弃去头几毫升滤液，然后分别吸取５ｍL样品及标准溶液的滤液分置于2５mＬ及10０ｍL放有5mL硼酸-乙酸钠溶液(3.5）的容量瓶中,静止１5miｎ后,用蒸馏水定容。以此作为标准溶液及样品的空白溶液。

6.2.2 在此１5min内，吸取另５mL样品及标样于其他两个２5ml及１00mＬ放有5mL乙酸钠溶液(3.4）和约15mL水的容量瓶中,用水稀释至刻度。

６．2．３ 分别吸取2mL的样品、标样及样品和标样的空白溶液于4支试管中。 6．2.４ 向每支试管中加入５mL邻苯二胺(3.6）,摇匀,在避光条件下放置3５ｍiｎ后,立刻于激发波长３50nｍ,发射波长430nm条件下测定其荧光值。 7. 结果计算

样品中维生素C含量(ｍg/10０g)=

式中： I——样品荧光值； Iｂ——样品空白溶液荧光值；

IIbC5Dk

ISISbm100 Is——标样荧光值; Ｉsb——标样空白溶液荧光值; c——标样质量浓度,mg/mＬ； m——样品的质量,ｇ。 8. 允许差 同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的１0%。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

YＬNB 5.5 一.脂肪的测定:

1. 依据: IDF５:20０４（E)。 2. 范围:酪蛋白含量较高的奶酪制品。 3. 试剂：

３.１盐酸溶液:质量分数约25%，即将浓度为3７%的浓盐酸675ml加水稀释至

1000ml，摇匀,此溶液要求保证盐酸的浓度。 3.2乙醇或由甲醇变性的乙醇:体积分数至少为９4%。

3．3乙醚：不含过氧化物,不含抗氧化剂,或抗氧化剂含量不大于２mg/ｋｇ，并满

足空白试验的要求。 3．4 石油醚:沸程３0-60℃。

3.5 混合溶剂：等体积混合乙醚（3.3）和石油醚（3.４），使用前配制。 4.设备:

4．1 离心机:可安放脂肪抽提瓶，转速为5０0-６０0ｒ/ｍｉn，可在抽脂瓶外端产生80—９0g的重力场。

4．2蒸馏器或蒸发器:可在不超过１00℃情况下,蒸馏除掉脂肪收集瓶中的溶剂和乙醇.

４ .3烘箱:温度可控制在１０2±2℃。 ４.4水浴:温度可控制在６5℃±5℃。

4.5毛氏抽脂瓶：抽脂瓶应带有适当的优质软木塞或其他不影响溶剂使用的瓶塞（如硅胶或聚四氟乙烯）。软木塞应先浸于乙醚中,后放入６0℃或60℃以上的水中保持至少15min，然后在水中冷却,使用时木塞已饱和，不用时要一直浸泡在水中,浸泡

奶酪的检测

用水每天更换一次。 4.6 支架：放置抽脂瓶。

4.7 洗瓶:适合装混合溶剂,不能使用塑料洗瓶。

4.8脂肪收集瓶:例如:容量为１00－250ｍｌ可加热三角瓶(平底烧瓶）， 4.9 沸石：无脂肪、无气孔的瓷片或碳化硅或玻璃珠（用金属皿的情况下）。 ４.1０ 量筒:5mｌ和25ml。 4．11吸量管：10mｌ刻度吸管。

４.12 金属夹钳：用于夹烧瓶、烧杯和皿。

４.１3 毛氏抽脂瓶摇混器:可夹放毛氏抽脂瓶，摆动频率为100±10次/min。 5 操作步骤

５．1 脂肪收集瓶的准备

在干燥的脂肪收集瓶中加入几粒沸石,放入烘箱中干燥１h。使收集瓶冷却(防尘)至天平室的温度（玻璃收集瓶至少需要1h,金属皿至少0.５ｈ）。收集瓶不可放入干燥器中,避免冷却不充分或冷却时间过长。 5.2样品操作:

５.2.１称取1g样品于抽脂瓶中，加入8－９ml的2５%的盐酸,在沸水浴中加热溶解20-3０分或在电热板上加热10分钟，直到溶解，时而振荡一次,取出,用水冷却至室温。同时作空白,在抽脂瓶中不加样品,只加入10mＬ2５%盐酸,其他操作同样品检测。

５．2.2加入10mL乙醇，轻轻地使内容物在小球和柱体间来回流动，彻底地进行混合,避免太接近瓶颈。

5．２.３加入2５mL乙醚,塞上被水饱和的软木塞，或用水浸湿的其他瓶塞，将抽脂瓶保持在水平位置，小球的延伸部分朝上夹在摇混器上,按约10０次/min振荡烧瓶1min,不要过度(避免形成持久乳化液)。必要时将抽脂瓶放在流水中冷却,然后小心地打开塞子，用少量的混合溶剂冲洗塞子和瓶颈 冲洗时使用洗瓶，使冲洗液流入抽脂瓶或已准备好的脂肪收集瓶中。 注：如没有摇混器，可用手进行振荡。

5.2.4 加入2５mL石油醚，塞上重新润湿的塞子(浸入水中），接5．2.3所述，轻轻

振荡３0s。

5．２.５.将加塞的抽脂瓶放入离心机中,在500－6０0ｒ/min下离心5min。如果没有离心机，则将抽脂瓶放到支架上，静止至少3０min,直到上层液澄清,并明显与水相分离。必要时,放在流水中冷却抽脂瓶。

5．2.６ 小心地打开软木塞或瓶塞，用少量的混合溶剂冲洗塞子和瓶颈内壁,使冲洗液流入抽脂瓶或脂肪收集瓶中。

如果两相界面低于小球与瓶身相接处，向抽脂瓶壁边缘慢慢地加入水，使液面高于小球和瓶身相接处，以便于倾倒。

5．2.7 手持抽脂瓶的小球部，小心地将上层液尽可能地倒入已准备好的含有沸石的脂肪收集瓶中，避免倒出水层。

5．2.8 用少量混合溶剂冲洗瓶颈外部,冲洗液收集在脂肪收集瓶中。小心操作，以防溶剂溅到抽脂瓶的外面。

按上所述，采用蒸馏或蒸发的方法,去除脂肪收集瓶中的溶剂或部分溶剂。 ５．２.9 重复操作，进行第二次抽提,不加乙醇，只用１5ｍL乙醚和15ｍL石油醚,用混合溶剂冲洗瓶颈内壁。

5.２.10 重复操作,进行第三次抽提，只用15mL乙醚（3.5）和1５ｍL石油醚,用混合溶剂,冲洗瓶颈内壁。

5.２.11采用蒸馏的方法去除收集瓶中的溶剂，蒸馏前用少量混合溶剂冲洗瓶颈内部。

5．2.１2 将脂肪收集瓶放入１02℃±2℃的烘箱(４.3）中加热1h,取出收集瓶，冷却至天平室的温度(不要放入干燥器中，但要放防尘，玻璃容器冷却至少1ｈ,金属容器冷却至少0.5h)。称量,精确至0.1mｇ。称量前不要擦收集瓶。用夹钳将收集瓶放到天平上(避免温度变化）。

5.2.1３ 重复操作,直到脂肪收集瓶两次连续称量不超过０.５ｍg，记录收集瓶和抽提物的最低质量。 ６. 分析结果表述 样品中脂肪的含量（g/1０0g）=

m1m2m3m4m0100

式中:ｍ0—样品的质量(5．2．1)，g；

m１— 烘干后测得的脂肪收集瓶和抽提物的质量,g； ｍ２—脂肪空收集瓶的质量,g;

m3—空白试验中,测定后烘干的脂肪收集瓶质量，g; m4—空白试验中脂肪收集瓶的质量， g。 报告质量分数结果精确至０.０１% 7 允许差 7.１重复性

同一实验室、同一分析人员、使用同一种方法、相同的检测设备，对同一样品在短时间内进行试验,在所用检测的样品中,不得有5%的样品的两次测定结果的绝对差值超过0.30%； 7.2 重现性

不同实验室,不同分析人员,不同检测设备，使用同一种方法对同一样品进行试验，在所用检测的样品中,不得有5%的样品的两次测定结果的绝对差值超过0.40%; 二、奶酪食盐的检测

1、依据：AＳ２3０0．1.3-19８8 2、试剂：

２.1 ０.０5 mol/L的硝酸银；

2.２ ０.0５ moｌ/L的硫氰酸钾标准溶液； 2.3 去离子水; 2.4 ５ mol/L的硝酸;

２.5硫酸亚铁氨指示剂:在５0g硫酸亚铁氨中加入90mL水和5mＬ5mol／L硝酸混

合； 3、操作步骤：

3.1称取2ｇ(准确到0.０05g)样品于２５0mL的三角瓶中;

3.２加入10mL去离子水和25mL0.０5moｌ/Ｌ的硝酸银,在7５—80℃的水浴中加热

使其溶解；

3.3加入1０mL浓硝酸并不断搅拌到混合均匀，约7－10分钟,使溶液澄清,脂肪得

到分离;

3.4加入2mL硫酸亚铁氨指示剂和1０mL水，用0.05mol／L的硫氰酸钾标准溶液滴

定至橘红色，1５秒不褪色,同时作空白实验,不加样品,其他同上，得到消耗硫氰酸钾的体积Ｖ０。

3.5 通过消耗的硫氰酸钾溶液的体积V计算奶酪制品的食盐含量； 其中: 1mL0.０５moｌ/Ｌ的KCNS=0.002９2ｇＮａCl

4. 计算结果: 食盐含量%其中：

W—样品质量,g;

V—消耗硫氰酸钾体积,ｍL； V0—空白消耗硫氰酸钾3体积，mＬ； C-硫氰酸钾摩尔浓度，mol/Ｌ;

0.０0２92—1ml0．05 mｏl/L的硫氰酸钾溶液相当的氯化钠的克数。 计算结果保留到小数点后两位。

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V0V0.00292WC0.05100

乳与乳制品非常规理化指标检验

YＬＮＢ 5.６

1.依据:GB/T5413．２2—1９9７ ２．原理

样品经湿法消化后定容，在硝酸溶液中,磷与钒钼酸铵生成黄色的络合物(P2O5.V2O３．２2MoO3.３H2O）,其黄色的深浅可用比色法比色测定,其测定范围为磷的浓度在２-2０ｕg/mｌ之间。 ３. 试剂

3.1、硝酸:优级纯。 ３．2、硫酸:优级纯。 3.３、高氯酸:优级纯。 3.4、钒钼酸铵试剂:

A液:25g钼酸铵[(NＨ4)6Mo7O２4..4H2O］水中,溶于400mｌ水中。

B液:1.25g偏钒酸铵（NＨ４VＯ3)溶于300ｍl水中,冷却后加2５0ml浓硝酸,然后将A液缓缓倾入Ｂ液中,不断搅拌,并用水稀释至1Ｌ，贮存在棕色瓶中。 3.5、氢氧化钠:6moｌ/L 3.6、二硝基酚指示剂:2g/L.

称取0．2g ２,6-二硝基酚或２,4二硝基酚［C6H3ＯH（NＯ２)２]溶于100ｍＬ水中。

３.7、磷的标准储备液:５0ug/ｍL

称取０.２19７ｇ经烘干的磷酸二氢钾(优级纯）,溶于约40０ml水中,加25mLH+浓度为1２mol/Ｌ的硫酸,定容至1L,可长久贮存．

磷的检测

3．8、氢氧化钠：０.1ｍｏｌ/L(作调节颜色用) 3.9、硝酸:０.1mｏl/L(作调节颜色用) 4. 仪器 4.1 分光光度计

４.２ 电热板或可调电炉(带石棉网) 5. 方法 5.1 样品处理,

精密称取0.5000g固体样品或2.5g（或mL）液体乳(可根据磷的含量确定称样量）样品于100mL或150mL三角瓶中,加入几粒玻璃珠,加10mL浓硝酸（4．1),然后放在电热板上加热反应.待剧烈反映结束后取下,冷却,再加入５ｍL硝酸，5mＬ硫酸（4.2）和５mL高氯酸(4．3）,重新放置在电炉上加热反应,此时应把温度调低些,若消化液变黑,需取下在加5mL硝酸后继续加热，直到消化液变成无色或淡黄色，在消化液剩下３-5ｍL时取下,冷却，定量地移入50mＬ容量瓶中，冷却后用水定容至刻度,为待测液,同时作空白实验。 5.2样品测定;

精确吸取样液10 mL（含磷０．2-0．7５ｍg）加少量水,加２滴二硝基酚指示剂（７),用氢氧化钠（6）调至微黄色，再分别加入10.0０ｍL钒钼酸铵试剂(混合后的Ｂ液),冷却，加水待冷却后用水定容。在25-３０℃下显色15ｍｉn。 5．3标准曲线的绘制:

5．3.1 精确吸取磷的标准储备液0, 2．5,７.5,10，１5，２0 ｍl分别放入50mｌ容量瓶中，磷的浓度分别为0，２.５, 7.5,１０，１5，２0ug／ml(也可以将磷的浓度在曲线内设的点适当增加，如１,１．5，２,3,4，1２.5 ，2０，2５ug/ｍl) ５.３.２ 分别加少量水后,加２滴二硝基酚指示剂，用６moｌ/l氢氧化钠调至微黄色，再分别加入10.０0ml钒钼酸铵试剂，定容。在25—30°C下显色１5分钟。 5.3.3 用１cm比色皿,波长4４０nm,在分光光度计上测定吸光值，以吸光值为纵坐标，磷含量为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。 6. 结果计算

磷的含量（mg/１00g)=

CVA100

m1000 c:从标准曲线上查的比色液的浓度，ｕg/mｌ; A:样液的稀释倍数; V：样液定容体积; 5０ mL m：样品的质量，g

允许差：同一样品两次测定值之差不超过两次测定平均值的5% 7．注意事项

７.1 样品处理必须采用湿法处理,可采用HＮO3— H ２SO4 --－HCLO４和HNO3 ---HＣLO4，两种方法,但都必须在通风橱中进行.

7.2 实验时要注意安全。硝酸和高氯酸加入的量不能太多,测定液体样品时要在水上蒸干，冰淇淋不能称的太多,一定要加入玻璃珠。 7．3 需要做空白实验。不加样品，其他相同。 7．４ 需准确加入钒钼酸铵的量。

7.5 标准曲线的制作,使样品的浓度在曲线范围之内。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

亚油酸、DHA、AA的检测 YＬNＢ ５.７ １. 范围

本方法规定了用气相色谱法测定亚油酸、DＨA和AA的方法。

本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中亚油酸、DHA和ＡＡ含量的测定。 2. 原理

抽提出样品内的脂肪,经甲基化反应后，以气相色谱，火焰离子化检测器定量测定样品中的亚油酸、DＨA和ＡA的含量。 3. 试剂

所有试剂,如未注明规格,均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

3.1 高峰氏淀粉酶（Taka-Diasｔaｓe）。 ３.2 氨水:体积分数≤25%。 3．3 乙醇：体积分数≥９5%。 3.4 乙醚。

３．５ 石油醚：沸程，３0~6０℃。 ３．6 正己烷：色谱纯。

３．7 氢氧化钾的甲醇溶液:c(ＫＯＨ)为4mol/L,使用无水甲醇。 ３．８ 标准溶液

３.8．1 DHA 标准贮备液:将５0mg ＤHA 标样用正己烷溶解并定容至５0mL，此溶液溶度为1ｍg／ml，冷冻保存。

３.8.２ AA标准贮备液:将1００mg AA 标样用正己烷溶解并定容至50mL,此溶液

溶度为2ｍｇ/ml,冷冻保存。

3.8.3亚油酸标准贮备液:将１g亚油酸标样用正己烷溶解并定容至50mL，此溶液溶度为20mg/ml,冷冻保存。

3．8.3 DHＡ 标准工作液：取标准贮备液２.００mL，用正己烷烯释并定容至２5mL。此溶液溶度为8０ug/mｌ。

3.8．4 ＡA标准工作液：取标准贮备液1.０0mL，用正己烷烯释并定容至25mL。此溶液溶度为8０uｇ／ml。

3.8.５亚油酸标准工作液：取标准贮备液1.00mＬ,用正己烷烯释并定容至25mＬ。此溶液溶度为8０0ug/ｍｌ。

3.9 刚果红：１g刚果红溶于水中，稀释至１00mｌ。 4. 仪器及器材 ４．1 毛氏抽脂瓶。 4．2 离心机。 ４．3 水浴锅。 ４．４ 振摇器。 4.5 气相色谱仪。 4.6 火焰离子化检测器。

４.7 色谱柱:ＤB－ＷAＸ，3０m×0．２5mm。 5． 方法 5.1 样品处理 5．1．1 含淀粉样品

准确称取1.0000g样品放入毛氏抽脂瓶中,加入0．1gTaｋa淀粉酶,再加入10ｍL45～5０℃的蒸馏水，混合均匀后，用氮气排除瓶中空气，盖上瓶塞,置45℃烘箱内30miｎ,取出冷却室温。 5.1.2 不含淀粉样品

准确称取样品约１．0000ｇ,放入毛氏抽脂瓶(4.1)中，用10mL65℃的热水溶解,振摇，使样品完全分散,水冷却至室温。 5.2 测定液的制备

5．２.1 于上述样品溶液中加入2mL体积分数为25％的氨水(3.2),置于60-70℃水浴（３.3）中15min，取出轻摇,冷至室温。

５.2.2 加入10mL乙醇（3.3），两滴刚果红,混匀。加入２５mL乙醚(3.4）,塞上塞子振摇1miｎ。再加入25mL石油醚，塞上塞子振摇1min。离心或静止，使醚层、水层分开。第二次提取加入的试剂为5mＬ乙醇、1５mL乙醚、15mＬ石油醚，操作同前。第三次提取不加乙醇,用15ｍL乙醚、石油醚，如上操作。

5．２.３ 把提取的醚液合并，水浴浓缩至近干，用正己烷溶解残留物并定容至10ｍL，摇匀。准确吸取２mＬ此液于１0ｍL带盖离心管中,加入0.2ｍL氢氧化钾的甲醇溶液(3.7），振摇1ｍin以上,放置３0min(甲基化反应）。如果有机层混浊,可离心使之澄清。此有机层即为样品待测液。 5.３ 测定

5.3.１ DＨA、AA 测定条件 a） 进样器温度:2６０℃； b） 检测器（FID)温度:280℃; ｃ) 进样体积：１.０μl； d） 分流比:1：１5；

e) 柱温:１５0℃(1分钟）-５℃/min-22０℃(30分钟）; f) 柱压:130Kpａ。 亚油酸的测定条件 a) 进样器温度:260℃； b） 检测器(FID)温度:２８0℃； c） 进样体积：1.0μｌ; ｄ) 分流比:1：50;

e） 柱温：150℃(1分钟)－3℃/ｍin－2２0℃(1５分钟); f) 柱压：120Ｋｐａ。

5.3．2 定性测定 根据保留时间定性。 5．3．３ 定量测定 外标定量法。

注射一定量的标准工作液进入气相色谱仪,得到标样的峰面积Ai；

注射等体积的样品待测液进入气相色谱仪,得到样品中各组分的峰面积Bｉ。 ６. 结果计算

csiBiV100样品中各组分的含量（ｍg/1００g)=

Aim1000 式中:Ｂi——样品中组分ｉ对应峰面积；

csｉ——标准样中组分i的质量浓度,mg/mＬ； V ——待测样品的总体积，mL;

Aｉ ——标准工作液中组分i的峰面积; m ——样品的质量,g。

7 允许差

同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10％。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

YLNＢ 5.8

１. 依据 GＢ／Ｔ5413.11-１997

２. 范围 用荧光法测定维生素Ｂ1 的方法,适用于乳粉中维生素B1 的测定。 3. 方法提要

样品在稀盐酸溶液中消化，过滤,除去蛋白质等物质。如果样品中维生素B1系游离态,可直接在碱性铁氰化钾中氧化成噻嘧色素,在紫外光照射下发出荧光，其荧光强弱与噻嘧色素成正比；如果维生素B1系结合态,则须经酶解转为游离态,作荧光检测。检测所使用的激发波长E１ 为365nm,发射波长EM 为435nm。 4． 试剂和设备

所有试剂,如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水,如未注明其他要求,均指三级水。

４.1 盐酸：c（HCl)为0．1mol/L。 ４.2 氢氧化钠:c(ＮaOＨ)为150g/Ｌ。 4.3 正丁醇:重蒸馏。

４．４ 乙酸钠:c（NaAc)为2mol/L。

4．５ 酸性乙醇:体积分数为２0％。用盐酸调节pH为3.5～4．3。 4．6 淀粉酶（生化试剂)溶液:10０g／Ｌ。

４． 7 铁氰化钾:c［K３Fｅ(CN)６]为10ｇ/L，使用当天配制。 4．８ 标准溶液

4．8．1 维生素Ｂ1 标准贮备液，浓度为10０μg/mL。

维生素

B1 检测

准确称取50.0ｍg（在五氧化二磷干燥器内至恒量的)分析纯维生素B1盐酸盐,溶解于４０0ｍL体积分数为20%的酸性乙醇溶液（4.５)中,并定容于５0０ｍＬ棕色容量瓶中，于10℃左右贮存。

4．8．2 维生素B1 中间液，浓度为10μg/ｍL。

吸取上述标准贮备液5mL，用０.1mol/L盐酸（4．1)稀释至50mL,于10℃左右贮存。 4.8.3维生素Ｂ１标准工作液

吸取上述中间液1ｍL,稀释至5０mL，现用现配。

4．9碱性铁氰化钾:取４毫升１0g/L的铁氰化钾（4 .7），用15０g/L的氢氧化钠溶液(4．2）稀释至1００mL,配好后置于暗处４ｈ内使用。 4. 10荧光分光光度计。 ５． 方法 5．1 抽提

于１50mＬ三角瓶中准确称取2g左右样品,加盐酸（４.1）60mＬ,用铝箔纸盖住瓶口，在137.２~16１.７kPa压力（125℃)下消化半小时，冷却后，用乙酸钠(4.4）调pH值为4．５，然后加5mL酶溶液(4．６）,在37℃条件下保温过夜，过滤。 5．2 氧化

在两支25mL的试管中,分别5mL标样,在其中一个试管中，立即加入3ｍL碱性铁氰化钾(4.９）,混匀,立即加入10mＬ正丁醇，猛烈振摇15s以上,静止分层,待荧光测定,另一管不加氧化剂,以3mＬ的氢氧化钠(4.２）代替，作为空白。 同时吸取样液5mL于另两支试管中，作法同上。 5．３荧光测定

从每一试管中吸上层清液于另一试管中，加少量无水硫酸钠使溶液澄清,作荧光测定。 6. 结果计算

样品中维生素Ｂ1（ug/1０0g)＝ 式中:Is——样品荧光值； Ib——样品空白荧光值;

cIs-IbD100

IsdIsbmＩｓd——标样荧光值; Isｂ——标样空白荧光值； c——标样浓度，μｇ/ｍL; m——样品的质量,ｇ。 D——样品定容体积，ml。 7. 允许差

同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的５％。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

ＹLNＢ 5．９

１. 依据 GB/T 54１3．23—１99７ 2． 范围

本方法规定了用气相色谱法测定碘的方法。 本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中碘的测定。

３. 方法提要 把样品中的碘衍生成容易气化的衍生物后，经气相色谱分离，电子捕获检测器定量测定样品中碘的含量。 4. 试剂

所有试剂，如未注明规格,均指分析纯；所有实验用水,如未注明其他要求,均指三级水。

4.１ 高峰氏淀粉酶（Taｋa-Diaｓtase)。 4．2 碘化钾:光谱纯。

4.3 亚铁氰化钾:c[K4Ｆe(CN)6·3H2O]为109ｇ/L。称取109g亚铁氰化钾,用蒸馏水定容于10０0ｍL容量瓶中。

４．4 乙酸锌：c（ZnAc)为２19g/L。称取2１9g乙酸锌,用蒸馏水定容于1００0mＬ容量瓶中。 4.5 浓硫酸。

4.6 甲乙酮：色谱纯。 4.7 双氧水:体积分数为３.5%。

碘的检测

4.８ 正己烷:色谱纯。 4．9 无水硫酸钠。 ４．10 标准溶液

4．10．1 碘化钾标准贮备液：浓度为1mg/mL。

准确称取131ｍg碘化钾，用蒸馏水溶解并定容至1０0ｍL，冷藏保存。 4.1０．2 标准中间液:

取1mL标准贮备液，定容至25mL，其浓度为 40μg／mL； 4.10.3 碘化钾标准工作液:浓度为0．8μg／mL。 取浓度为40μg/mL的标准中间液1mL,定容至５0mL。 5. 仪器及器材 ５.1 分液漏斗:1０0ｍＬ。 5.2 容量瓶：50ｍL。 5．3 气相色谱仪。 5．4 电子捕获检测器。

5．5 色谱柱：DB-1 30m＊０．２5ｍm ，或同等性能的柱子。 6. 方法 ６.1 样品处理 6.1.１ 含淀粉的样品

准确称取样品5ｇ于三角瓶中,放入50mL容量瓶中，加入０.５ｇ高峰氏淀粉酶(3.1），再加入３０mL45~5０℃的蒸馏水，混合均匀后,用氮气排除瓶中空气,盖上瓶盖，置45℃烘箱内３0mｉｎ。 6.1.2 不含淀粉的样品

准确称取5ｇ于烧杯中，用30ｍL６５℃的热水溶解，转入5０mＬ容量瓶中。 ６．2 测定液的制备

6.２.1 于上述处理过的样品溶液中加入5mL乙酸锌（3.４)和５mＬ亚铁氰化钾(3.3）,并定容至刻度线，充分振摇后静止１0mｉn。

６．2.２ 过滤。吸取１0mL滤液于12５mＬ分液漏斗中，加10ｍＬ水。

6．2.3 加入0.7mL浓硫酸（3.５),0.5mL甲乙酮(３.6)，2mL体积分数为3．５％的双

氧水（３.７)，充分混匀后,静止2０ｍin。

6.2.４ 加入20ml正己烷(3.8)萃取，静止分层后，将水相移入另一分液漏斗，再次萃取。

6.２．5 合并有机相,加水２0ｍL,水洗后静止分层，放去水相。

6．２.6 用无水硫酸钠(3.9)干燥有机相后移入50mＬ容量瓶中并定容,此即为待测液。

标准工作液也按上述步骤制备。 6.3 样品测定 6.3.１ 测定条件 ａ) 柱温：１00℃;

b） 进样口温度：２00℃； ｃ) 检测器ECD温度:250℃； d） 进样体积：1.0μL; e) 分流比：1：15 f) 柱压:10０kPａ

6.3.２ 定性测定 根据保留时间定性。改变色谱条件，如柱温度、载气流速,使标准组分的保留时间发生改变。如果样品中的某个峰随标准样品中的某个峰的保留时间有同样的改变，即证明样品中含有与标样相同的某个组分。

6.3.3 定量测定 外标定量法。 注射一定量的经5.２步骤制备过的标准工作液进入气相色谱仪,得到碘的峰面积A;注射等体积的样品待测液进入气相色谱仪,得到样品碘的峰面积Bi。

7． 结果计算

样品中碘的含量(ug/100ｇ)=

100Bicv……………………………(1)

Aim式中:Bｉ——样品中组分ｉ(碘)对应峰面积;

c——标准样品中组分ｉ的浓度，μｇ／ｍL; V——待测样品的总体积，ｍＬ； Aｉ——标准工作液中组分i的峰面积； m——样品的质量,g。

8. 允许差 同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的５%。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

维生素A、E的检测 YＬNB ５．10 1. 范围

用液相色谱法测定各种婴幼儿配方食品和乳粉中的维生素A、E。 2． 方法提要

样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离,经(用)乙醚萃取后，用高压液相色谱,紫外检测器定量测定。 3. 试剂

所有试剂,如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水,如未注明其他要求，均指三级水。 3．１ 乙醚:脱醛 3.2 甲醇:色谱纯 3．3 异丙醇:色谱纯 ３．4 无水乙醇:色谱纯 ３．5 无水乙醇：分析纯

3．6 氢氧化钾溶液：质量体积比为５00ｇ/L 3.７ 抗坏血酸：100ｇ／Ｌ ３．８ 无水硫酸钠:分析纯 3.9 维生素A、E标准溶液

３.９.１ 维生素A标准贮备液,取适量维生素A醋酸酯同5.2处理。

3．9.2 维生素E标准贮备液,含维生素E400µg/mL 的乙醇(３.４ ）溶液。 称取４０mg的α-生育酚，用乙醇(3.4 ）溶解并定容于100mL容量瓶中。 称取４0mg的δ-生育酚，用乙醇(3.４ )溶解并定容于10０mL容量瓶中。 称取40mg的γ-生育酚，用乙醇（3.4 )溶解并定容于1０0ｍL容量瓶中。 3．9．3 维生素A、E标准工作液。

量取1mL维生素A标准贮备液（3.９．1)和2.5mＬ维生素E标准贮备液(3.９.2)于100ｍL容量瓶中,用乙醇（3.４ )溶解，0.45μm滤膜过滤,滤液作为标准工作溶液。

按照下表中的波长在紫外分光光度计上测定吸收值，并按公式（1)和表中系数计算浓度。

标样 维生素A （ＩU／ml) α－生育酚（μg／ml) δ－生育酚(μg/ml） γ-生育酚(μg/mｌ)

C（IU／mｌ或μｇ/ml）=

波长（nm) ３２5 2９4 298 2９8 系数（S) ３．３３/1８35 ７1 91.2 ９2.8 A10000 ………………………公式（１）

S 式中:Ｃ—标样浓度,IＵ/ml或μg/ml

A—在紫外分光光度计上测得的吸光值

S—系数 4. 仪器及器材

常用实验室仪器及: 4.1 圆底烧瓶：2５0mＬ。 4.2 分液漏斗:500mL。 ４.3 旋转蒸发仪。 4. ４ 摇床水浴锅。

4．5 高压液相色谱仪：具有可变波长的紫外检测器、数据处理系统或记录仪。 4. ６ 紫外分光光度计。 5. 方法 5.１ 样品处理

精确称取５.0000g样品（液态奶２0ｍｌ),置于250mＬ磨口三角瓶中,用水润湿。

5.２ 测定液的制备

5．2．1 皂化：于上述处理的样品中加入50mＬ乙醇溶液（３．5）,充分混匀后加１5mL氢氧化钾溶液(3．6）,再加入5mL抗坏血酸溶液(3.7）,在9０℃水浴锅中连续回流30min后,立刻冷却到室温。

５．2．2 转移:将皂化液定量转移到５00mL分液漏斗中，用少量水分几次冲洗磨口三角瓶,洗涤液并入分液漏斗中。

5.2.3 萃取:于上述分液漏斗中，加入１00ｍL乙醚(3.1），盖好瓶塞,倒置分液漏斗并剧烈振摇1mｉn,在振摇过程中,注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一５00ｍL分液漏斗中。重复上述萃取过程,合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性(用pH试纸测定）,通过无水硫酸钠过滤干燥，在50℃水浴和氮气流下,于旋转蒸发器上蒸至近干（绝不允许蒸干），取下,用氮气吹干，用无水乙醇(３.４)定量转移至5０mＬ容量瓶中,定容,0．４5μｍ滤膜过滤，滤液作为样品溶液。 5.３ 测定

5．3．１ 维生素A和E的测定 5．3.1.1 仪器条件

色谱柱：C１８ ,2５0ｍm×4.6ｍm，ODＳ柱或具等同性能的色谱柱。 流动相:甲醇∶水（98∶2）。 流速：１．０mL/ｍin。 灵敏度：０.005AU/ＭV。

波长:维生素A，３25nm；维生素E,29０ｎm。

5．3.1．2 注射20μL维生素A、Ｅ标样（3.9.３）和20μL样品溶液(5.2.３)，得到标样和样品溶液中维生素A和E的峰面积。 6. 结果计算

AsCsdV100

Asdm

AsCsdV100 样品中维生素E(mg /10０ｇ)＝

Asdm样品中维生素A（IU/100g）= 式中:m——样品的质量，g;

Aｓ——样品中维生素A或E的峰面积（或峰高); Asd——标样中维生素A或E的峰面积(或峰高）; Csd——标样中维生素A或E的浓度,IＵ/mL(或ｍg／mL）;

V ——定容体积，mL。 计算结果保留三位有效数字。。 7. 允许差

同一样品的两次测定值之差,维生素A不得超过两次测定平均值的5%；维生素E不得超过两次测定平均值的5%。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

山梨酸、苯甲酸、糖精钠的检测 YLNB 5.1１ 1. 原理

样品沉淀脂肪和蛋白质,调pＨ至近中性,过滤后进高效液相色谱仪,经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

2. 试剂ﻫ 方法中所用试剂,除另有规定外,均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度水，溶液为水溶液。2.1ﻫ 甲醇：经滤膜（０.45μm)过滤。 ２.2 稀氨水（1＋1)：氨水加水等体积混合。

2.3 乙酸铵溶液(0.0２mol/Ｌ):称取1.5４g乙酸铵，加水至１000mL,溶解，经滤膜（0.4５μm)过滤。

2.４糖精钠标准储备溶液:准确称取０.0851g经12０℃烘干4h后的糖精钠,加水溶解定容至100ml糖精钠含量1．０mg／mｌ，作为储备溶液。

２.5 碳酸氢钠溶液（20g/L):称取2g碳酸氢钠(优级纯),加水至1００ｍL,振摇溶解。2.6ﻫ 苯甲酸标准储备溶液:准确称取0．100０g苯甲酸，加碳酸氢钠溶液(2０g／L)5mL,加热溶解,移入１00ｍL容量瓶中，加水定容至1００mL，苯甲酸含量为１mg/ｍL，作为储备溶液。2.7ﻫ 山梨酸标准储备溶液：准确称取０.100０g山梨酸，加碳酸氢钠溶液(２０g／Ｌ)5mＬ，加热溶解，移入１00mL容量瓶中,加水定容至100ｍＬ,山梨酸含量为１ｍg／ｍＬ,作为储备溶液。2ﻫ．8 苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准混合使用溶液：取苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准储备溶液各1.0mL,放入10０mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸、糖精钠各1０uｇ／mL。经滤膜(０.４5μm)过滤

２.9草酸钾—磷酸氢二钠溶液:取草酸钾3ｇ,磷酸氢二钠7ｇ,溶解于10０mＬ水中。

2.10乙酸铅溶液:c（ＰbAc2）为200g/Ｌ。取2０ｇ乙酸铅，溶解与1０0 ml水中。ﻫ３. 仪器

高效液相色谱仪(带紫外检测器）。

4. 方法4.1ﻫ 样品处理4.1.1ﻫ 汽水:称取５．00~１０.0g样品，放入小烧杯

中,微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1+1)调pH约７。加水定容至１0～２0mＬ,经滤膜(0.４5μm)过滤。4.1.2ﻫ 果汁类:称取5.０0~10.0ｇ样品，用氨水(1+1)调pH约7,加水定容至适当体积,离心沉淀,上清液经滤膜(０．4５μm)过滤。 4.１．3 配制酒类:称取10.0g样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水（1＋1)调pH约7,加水定容至适当体积，经滤膜（0．４5μm）过滤。 ４．1.4 发酵酸奶:称取大约1５g酸奶，放入小烧杯中，用15ml水洗入5０ml容量瓶中，加乙酸铅和草酸钾磷酸氢二钠各4mｌ,每次加入试剂时都要徐徐加入，并摇动容量瓶，用水稀释至刻度。静止数分钟,用干燥滤纸过滤，滤液用氨水(1＋1)调ｐH约７，经滤膜(0．4５μm)过滤，备用。4.2ﻫ 高效液相色谱参考条件ﻫ４．2.1 色谱柱：YＷＧ－Ｃ18 4.６ｍｍ×2５０ｍm不锈钢柱或同等性能的柱子。ﻫ４．2．2 流动相:甲醇:乙酸铵溶液(0．０2mol/L)(5：9５)（根据情况可以调整)。

4.2．3 流速：１mL/mｉｎ。 4．2.4 进样量：2０μＬ。4ﻫ．2.5 检测器:紫外检测器，波长23０nm。ﻫ 根据保留时间定性，外标峰面积法定量。 5. 结果计算

X =

CV1  A样

mA标 式中：X——样品的含量,mｇ／kg； C ——标准使用液浓度，ug/ml；

V1——样品稀释液总体积，mL；ﻫ m ——样品质量,g ;

A样--- 样品的峰面积 ; A标----标样的峰面积 。

结果的表述：报告算术平均值的三位有效数。ﻫ６. 允许差：相对相差≤10%。 ７. 色谱图

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乳与乳制品非常规理化指标检验

维生素B6的测定 YＬNB 5.１２

１． 范围

本方法规定了用反相液相色谱法测定维生素B6的方法。 本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B6的测定。 2.原理

样品经热水萃取等前处理后，经Ｃ18色谱柱分离，荧光检测器检测,外标法定量维生素B6(吡哆醇 、吡哆醛、吡哆胺)的含量。 3. 试剂

所有试剂,如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。 3.1 高峰氏淀粉酶 3.2 盐酸溶液为:5mｏl/l 3．3 氢氧化钠溶液为:5mｏl/l 3.4 冰乙酸:优级纯 3．5 无水甲醇:色谱纯 3.6 辛烷磺酸钠:优级纯 ３.7 三乙胺体积分数≥99.９% 3.8 标准溶液

３.8.1 吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准贮备溶液浓度均为2０0uｇ/ｍl。

准确称取吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准品各用水溶解并定容至容量瓶中。 3．８.２ 吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺标准工作溶液,浓度均为2.0 uｇ/ml。

取1.0ml标准贮备溶液(３.８.1)，用水定容至100ml。 ４． 仪器

4.1 超声波振荡器。

4.２ 高压液相色谱仪:带荧光检测器。

4.3 色谱柱:30×４ｍｍ，C18或具有同等性能的色谱柱。 4．4 酸度计。 5. 方法 5.1 样品预处理 5.1．１ 含淀粉的样品

精确称取 5.０g 样品，放人150mL锥形瓶中，加入0．5ｇ Taka淀粉酶(３.1),再加入２5mL45- 5０℃的蒸馏水,混合均匀后,用氮气排除瓶内空气，盖上瓶塞，置450℃烘箱内30min,取出冷却至室温。 5.1．２ 不含淀粉的样品

精确称取5.0g 样品,放入150mL锥形瓶中，加入25mL6０℃的蒸馏水,振摇，静置5-ｌ0min,使样品充分溶解并降至室温。 5.２ 测定液的制备

5．2．1 用盐酸溶液（３.2）慢慢调节样品溶液的pH值至１.70 ,放置约1ｍｉn，再用氢氧化钠溶液（3.3)调节样品溶液的pH值至4．5０。

5．2．2 将样品溶液转移到50mＬ容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗锥形瓶,洗液合并于50mL容量瓶中,并用水定容至50ｍL.

5.２．3 把上述容量瓶放人超声波水浴(4.1）中,振荡1０mｉn

5．２．4 另取50ｍL容量瓶，上面放入三角漏斗和滤纸，把样品溶液倒入其中，自然过滤。滤液再经０.４5 um微孔滤膜加压过滤，用试管收集，即为样品待测液。

5.3 色谱条件ﻩ

检测灵敏度：0.０0２AＵ/ MV

检测器条件:荧光激发波长Eｘ:2９3nm,发射波长Em:395nｍ。 柱温 :30℃

流速 : 1.00ｍL/min

流动相 : 体积分数为5.０%的甲醇、0．2０ ｇ/ｌ00ｍＬ辛烷磺酸钠、体积分数为25%的三乙胺水溶液，用乙酸调ｐH＝ 3．００ 。 5.４ 定量分析(外标法)

注射一定量的标准工作液（３.８.2）进入色谱仪，得到组分i的峰高(或峰面积）Ai，注射等体积的样品待测液进入色谱仪,得到组分i的峰高(或峰面积)Bi。 6． 结果计算ｎ

样品中维生素B６的含量(mg/ｌ00g)= Ｘ醇 + X醛+ Ｘ胺······（1) 注：样品中维生素B６是各组分的含量之和． 样品中各组分含量(mg／1０0g）＝

CBiV100

mAi1000式中:Bi— 样品组分i的峰高或面积；

Ａｉ — 标准工作液中组分i的峰高或面积； C — 标准工作液中组分i的质量浓度,ｕg/ｍL； m — 样品的质量,g； V — 样品溶液体积，mL。 ７. 允许差

同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%．

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乳与乳制品非常规理化指标检验

烟酸和烟酸铵的检测 YLNB 5.13

1. 依据:ＧB/T 541３.15—1997 2. 方法提要

样品经热水萃取、酸性沉淀蛋白质后，以反相C１8 色谱柱分离,用紫外检测器定量。 3. 试剂

3.1 盐酸溶液：c(HＣl)为5.0moｌ／L

３．２ 氢氧化钠溶液:c（NaＯH）为５．0ｍol/Ｌ 3.３ 高氯酸:体积分数为６0% 3.4 无水甲醇:色谱纯 3．5 异丙醇：色谱纯 3.6 辛烷磺酸钠：优级纯 3．７ 标准溶液

3.7.1 烟酸及烟酰胺标准中间溶液,浓度为100μg／mＬ。

称取烟酸及烟酰胺标准品各10.0mg,用水溶解，然后分别定容至１00mL容量瓶中。

3.7.2 烟酸及烟酰胺混合标准工作溶液，浓度为5μｇ/mＬ。

各取５.0mL上述标准中间溶液于10０mL容量瓶中,用水定容(烟酸、烟酰胺浓度均为5μｇ/mL)。 4. 仪器

4.1 高效液相色谱仪:带紫外检测器。

4．2 色谱柱：１5cm×4.6mｍ,或同等性能的反相Ｃ18 柱。 4.3 酸度计。

４．4 超声波振荡器。 ５. 方法 5.1 样品预处理

5．1.1 称样：精确称取样品5.0ｇ（精确至小数点后第四位),放入１00ｍＬ锥形瓶中。

５．1．2 提取：在上述锥形瓶中，加入约6０℃的蒸馏水2５mL，摇匀后,置于超声波振器中振摇10min。

5.1．3 沉淀:待样品溶液降至室温后,用盐酸溶液（10.1）调节样品溶液的pH值至1.7０,放置２min后,再用氢氧化钠溶液(１0.2)调节样品溶液的pH值至4．50。 5.１.４ 定容:将样品溶液转至50ｍＬ容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗锥形瓶,洗瓶合并于5０ｍL容量瓶中，用水定容至刻度后,倒入漏斗中自然过滤。取此滤液约10mL,经0.４5 μm微孔滤膜加压过滤,即样品溶液。 5.2 仪器工作条件

检测器灵敏度:0．0０２AU/mV。 检测器波长：26１ｎm。 柱温:25℃。

流速：1.０0ｍL/min。

流动相：体积分数为7.０%的甲醇、体积分数为2．０%的异丙醇、１g/L辛烷磺酸

钠的水溶液,用高氯酸调pＨ＝2.１0。

进样量:２０μｌ ５.3 定量分析

5.3．1 上机测定：注射一定量的样品溶液进入液相色谱仪,得到峰面积Ai；注射与样品溶液相同体积的标准工作液进入色谱仪，得到峰面积Bi。 6. 结果计算

样品中烟酸的含量(mg/100g）=X1+X2…………………………(1） 式中：X1——样品中烟酸的含量,mｇ/１00g； X2——样品中烟酰胺的含量，mg/1００g。 其中Ｘ1或X2 : Ｘ１(Ｘ２）=

AicxV …………………………（2)

Bim

式中：m——样品的质量,ｇ;

Ai——由4．3．1所得的样品溶液的峰面积;

Bｉ——由4.3.1所得的标准工作液的峰面积； cx——标准工作液中烟酸或烟酰胺的浓度,μg/mＬ； V——样品溶液的体积,mＬ。 7 允许差

同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的10%。

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乳制品中钙、镁、铁、锌、钾、钠、铜、锰的检测 YLNB 5.14

1． 范围

本方法规定了用原子吸收分光光度法测定钾、钠、钙、镁、铁、锌、铜 和锰的方法。

本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中钾、钠、钙、镁、铁、锌、铜和 锰的测定。 2. 方法提要

样品经干法(或湿法)灰化,分解有机质后，加酸使灰分中的无机离子全部溶解，直接吸入空气－乙炔火焰中原子化,并在光路中分别测定钾、钠、钙、镁、铁、锌、铜和锰原子对特定波长谱线的吸收。测定钙、镁、钾、钠时,需用镧作释放剂，以消除磷酸等的干扰。 ３. 仪器及器材

3.1 原子吸收分光光度计和空气压缩机。

3．2 钾、钠、钙、镁、锌、铁、铜、锰空心阴极灯。 ３．3 高纯乙炔气。 3．４ 石英坩埚或瓷坩埚。 ３. 5 三角瓶：1５0mL。 3. ６ 吸管、移液管或移液枪。 3.7高温炉。 ４. 试剂

实验用水为二级水,试剂均为优级纯。 ４．1 浓盐酸。

4．2 盐酸:体积分数为2%。 4．3 盐酸:体积比1：4。 ４.4 硝酸:体积比１:1。 4．5 镧溶液：镧的浓度为５0g/L

称取29．32g氧化镧（Lａ2O3),用2５mL去离子水湿润后，慢慢仔细地添加125mL浓盐酸使氧化镧溶解后,用去离子水稀释至５00mL。

4.6 钾标准贮备液：钾离子的质量浓度1000 μｇ／ｍＬ。 ４.7 钠标准贮备液：钠离子的质量浓度1000 μg/ｍＬ。 ４.８ 钙标准贮备液：钙离子的质量浓度1000 μg/mL。 4．9 镁标准贮备液：镁离子的质量浓度1０0０ μg/ｍL。 4.10 锌标准贮备液：锌离子的质量浓度10０0 μg/mL。 4．１1 铁标准贮备液：铁离子的质量浓度１0００ μg/ｍL。 4.12 铜标准贮备液:铜离子的质量浓度1000 μｇ/mL。 4.１3 锰标准贮备液：锰离子的质量浓度1０００ μg/mL。 4．１４ 各离子的标准中间液:质量浓度均为100 μg／ｍＬ。

分别吸取４．6、4．７、４.8、４．9、４.10、4．1１、4.12和4.13标准贮备液10mL于８个10０ｍL容量瓶中，用盐酸（４.2）定容,得到上述离子的标准中间液。 5. 方法 5.1 标准曲线

５.1.1 标准混合溶液的配制

按表1给出的体积,配制各元素标准工作液。即分别吸取铁、锌、铜、锰标准中间液（4.1４）于100mＬ容量瓶中用盐酸(4.2)定容,即为铁、锌、铜、锰标准溶液;分别吸取钙、镁、钾、钠标准中间液(4.１4）于100mL容量瓶中，加２mL镧溶液(４.5）用盐酸（4.2）定容，即为钙、镁、钾、钠标准溶液。各元素浓度如表２。 表1 配置标准溶液所取各元素标准中间液的体积ｍL 标准工作液的序号 1 2 3 4 ５

表２ 标准溶液各元素的浓度ｕg／mL

0.5 1 1.5 ２ 2．5 1 2 ４ 5 － 0.5 １ 1.5 2 2．5 0．1 0.2 0.3 ０.4 ０．5 0．５ 1 1．5 2 - 1 ２ 3 4 ５ 0.１ 0.２ ０.4 0.6 ０.8 0.１ ０.2 0．4 0.6 0.8 K Ca Nａ Mg Ｚn Ｆe Cｕ Mn 序号 1 2 ３ 4 5

K ０．5 1 1.5 2 2．5 Ca 1 2 ４ 5 - Nａ ０.5 1 1.5 2 2.５ Mg 0.1 ０．2 ０.3 0．4 ０.5 Zn 0.5 1 1.5 2 - Fｅ １ 2 3 4 5 Cu 0．1 0.２ 0.4 0.6 0.8 Ｍn 0．1 0．2 0.4 0.６ ０.8 5．1.2 标准曲线的绘制

按照仪器说明书将仪器工作条件调整到测定各元素最佳状态,选用灵敏吸收线K766.5nm、Ca422.7nm、Na588.９ｎm、Mｇ285.2nm、Fe248.3nｍ、Cu ３2４.7ｎｍ、Mｎ27９.5nm、Zn2１3.９ｎｍ将仪器调好预热后，用毛细管吸喷盐酸(4.2)溶液,测定钾钠钙镁时用含镧1g/Ｌ的体积分数为2%的盐酸(HCl)调零。分别测定标准溶液中各离子的透光率，对各元素含量绘制标准曲线并计算出回归方程，要求相关系数大于等于0.99５。 5.2 样品处理

干法灰化处理:精确称取粉类样品2．０g（检测铜、锰时5.0 g）(精确至小数点后第四位)，液体样品５g(或5mL)于坩埚（3.4)中,在电炉上微火炭化至不放烟，再移入高温炉（３.7）中升温至４９0℃使样品灰化成白色灰烬。如果有黑色炭粒，冷却后,则滴加少许１：1的硝酸（４.4）湿润。在电炉上小火蒸干后，再移入490℃高温炉中继续灰化成白色灰烬，取出，冷却至室温，加１:4的盐酸5mＬ，在电炉上加热使灰烬充分溶解，冷却至室温后,移入100ｍｌ(铜、锰移入２5 ml）容量瓶中，用去离子水定容,同时处理一个空白样品。（样品处理好定容的体积可根据样品中元素的含量选择）

湿法消化处理: 精确称取粉类样品2．０ｇ(检测铜、锰时5．0 g）（精确至小数点后第四位),液体样品５g(或５ｍL)于１50mL的三角瓶中，放数粒玻璃珠，加硝酸 20mL ,5mL高氯酸（可适当按比例减少酸的用量）,加盖浸泡过夜,次日加一小漏斗(可选择使用)置于电热板上加热消解。若变棕黑色，再加

少量添加混合酸（硝酸和高氯酸）,直至冒白烟,消化液呈无色透明或略带黄色,放冷备用。(注意不可使瓶内液体烧干)用滴管将试样消化液洗入10０ml（铜、锰移入25 ml）容量瓶中，用去离子水定容,同时处理一个空白样品。（样品处理好定容的体积可根据样品中元素的含量选择） ５. 3样品的测定

调整好仪器最佳状态,用相应的盐酸溶液（４.2)调零后，按下面的方式测定样品的透光率及试剂空白。 ５．3．1 钾的测定

从１00mL样液中吸取１ｍL于10０mＬ容量瓶中，加2mL镧溶液,用盐酸(4.2）定容,上机测定。 5.3．２ 钙、镁、钠的测定

从100mL样液中吸取1mL于50mL容量瓶中,加镧溶液1mL,用盐酸（4.2)定容，上机测定。 5.3.3 铁、锌的测定

用100mL样液直接上机测定。 5．３．4 铜、锰的测定

用25ｍL样液直接上机测定。 6． 结果计算

(c1－c2）×V×A

样品中元素含量（mg／Kg）= ----－-－--------－---－----－---×1００ ｍ×1000 式中：

ｃ1——测定液中元素的浓度，μg/mL; ｃ2——测定空白液中元素的浓度，μg／mＬ； V——样液体积,mL； A——样液稀释倍数; m——样品的质量，ｇ。

7. 允许差

同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5%。

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乳与乳制品非常规理化指标检验

乳制品中铅的检测

YＬNB 5.1５ 1． 范围

本方法规定了用石墨炉原子吸收光谱法测定乳制品中铅的方法。 本方法适用于食品中铅的测定。 本方法的检出限为５ μg/kｇ。 2. 原理

试样经灰化或酸消解后，注入原子吸收分光光度计石墨炉中,电热原子化后吸收283.3nm共振线，在一定浓度范围，其吸收值与铅含量成正比，与标准系列比较定量。 3. 试剂

3．1 硝酸（优级纯）。 ３．2 高氯酸（优级纯)。

3.３ 混合酸（４+1） :4份硝酸+１份高氯酸。

３．4 硝酸（0.５ｍｏｌ/L）：取3．2mL硝酸加入50mＬ水中,稀释至100ｍＬ

3.5 铅标准储备液：此溶液每毫升含1．０mｇ铅。

铅标准使用液：每次吸取铅标准储备液1.0mＬ,于10０mL容量瓶，加硝酸(0．５mol/L）或硝酸(１．0mｏl/L)定容至刻度。如此经多次稀释成每毫升含5.0，1０．0、2０．0、4０.0、6０.0、8０．0ｎg铅的标准使用液。测定时标准系列可根据样品的含量及取样量选择。 3．６过氧化氢(30%）。 ４． 仪器及器材

4.１ 石墨炉原子吸收分光光度计。 ４．2 电热板。 4．3 微波消解仪。 4．4 自动控温消化炉。 4． ５ 三角瓶

4.6 吸管，移液管或移液枪。

4.7 10mL比色管或1０ｍＬ容量瓶。 4．8 玻璃珠。 5. 方法

５．1试样预处理

在采样和制备过程中,应注意不使试样污染。 ５. 2试样消解 5. 2.1 湿消解：

称取试样1.00～５.0０ ｇ或１.00~５.０0mL（根据铅含量而定）, 置入150mＬ锥形瓶或高脚烧杯中，放数粒玻璃珠，同时做两份试剂空白。加硝酸 ２０mＬ ,5ｍL高氯酸(可适当按比例减少酸的用量)，加盖浸泡过夜，次日加一小漏斗(可选择使用)置于电热板上加热消解。若变棕黑色,再加混合酸,直至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色，放冷备用。（注意不可使瓶内液体烧干）用滴管将试样消化液洗入或过滤入（视消化后试样的盐分而定)10ｍL ～25mL容量瓶（或比色管)中,用水少量多次洗涤锥形瓶,洗液合并于容量瓶(或比色管)并定容至刻度，混匀,备测。 5. 2.2 干法灰化

称取1.00~５.0０ g或1．０0～5.00mL（根据铅含量而定),置入１5０mＬ瓷坩埚中，先小火在可调电热板上炭化至无烟，移入马弗炉500℃灰化6～８小时,冷却。若个别试样灰化不彻底,则加１ mＬ混合酸在可调电炉上小火加热，反复多次直到消化完全,放冷,用硝酸(0.5mol／L）将灰分溶解,用滴管将试样消化液洗入或过滤入（视消化后试样的盐分而定)10mＬ ～２5ｍL容量瓶中,用水少量多次洗涤坩埚，洗液合并于容量瓶并定容至刻度，混匀,备测,同时做试剂空白。

5. 2.３ 微波消解

根据样品性质称样于微波消解罐，按仪器附带的样品处理方法汇编处理样品。 ５.３ 测定

５.3.1 仪器参考条件:

5.3.1.１ 仪器开机后，首先进行自检,经检查一切正常后,预热１5 miｎ。

5.3.１.２ 波长根据使用的仪器选择：一般为238.３nm。 5.3.1.３ 仪器进样方式可选择自动进样或手动进样。 6. 结果计算

按式(1）计算试样的铅含量: X=式中：

X—试样的铅含量,单位为毫克每千克或毫克每升（mg／Kg或mg/Ｌ） V—试样消化液定容体积,单位为毫升( ｍl )

C1—试样被测液的浓度,单位为纳克每毫升（ ｎg/ml ） C0—试样空白液的浓度,单位为纳克每毫升( ｎｇ/ml ） Ｍ—试样的质量或体积,单位为克或毫升(g或mｌ) 注意:计算结果保留两位有效数字。 7． 精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

8． 注意事项

本实验使用玻璃器皿必须用硝酸（1＋5）浸泡过夜,用水反复冲洗，最后用去离子水冲干净。操作中注意污染。

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(C1C0)V ——(１)

M1000

乳与乳制品非常规理化指标检验

乳制品中总砷的检测

YLNB 5．16 １. 范围

本方法规定了用原子荧光光度法测定乳制品中总砷的方法。 本方法适用于各类乳、乳制品中总砷的测定。 本方法检出限为0.01 mｇ/Kｇ。 2. 原理

试样经湿消解或干灰化后，加入硫脲使五价砷预还原为三价砷，再加入硼氢化钠或硼氢化钾使还原生成砷化氢,由氩气载入石英原子化器中分解为原子态砷，在特制砷空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光,其荧光强度在固定条件下与被测溶液中的砷浓度成正比，与标准系列比较定量。 3. 试剂

3.1 氢氧化钠溶液(5 ｇ/Ｌ)。

３.2 硼氢化钾溶液（10 g/L ）:称取硼氢化钾１０.0 ｇ溶于5 g/Ｌ氢氧化钠溶液1０0０mL中,混匀。使用时现用现配。

3.3 硫脲溶液（50 g/L ）:分别准确称取10ｇ硫脲和1０ｇ抗坏血酸去离子水溶于200 mL容量瓶中，定容至刻度。 3.４ 砷标准溶液

3.４.1 砷标准储备液:含砷0．1mｇ/mL。

３.４.2 砷使用标准液：含砷1 μｇ/mL.吸取1.00mL砷标准储备液于１00ｍL容量瓶中,加５ mL盐酸,用水定容至刻度。此液应当日配置使用。 ３.5 湿消解试剂：硫酸（优级纯)、高氯酸（优级纯）、硝酸(优级纯）。 ３.6 混合酸(4＋1） :4份硝酸+1份高氯酸。 3.7 干灰化试剂:六水硝酸镁(１５０g/L）、盐酸（1+１）。

3．8 硫酸（1＋9）：量取10０ mＬ硫酸小心倒入9０0 mＬ去离子水中,混匀。 4. 仪器

４.１ 原子荧光光度计。 4.2 电热板。

5. 方法 5．1 试样消解

５.1．1 湿消解:固体试样称样１－2.5 g（精确至小数点后第四位）,液体试样称样5-10 ｇ (或mＬ ）(精确至小数点后第二位),置入５0-１0０mL锥形瓶中,同时做两份试剂空白。加混合酸２5mL ,摇匀后放置过夜,置于电热板上加热消解。若消解液处理至10mL 左右时仍有未分解物质或色泽变深,取下放冷，补加硝酸5-10mＬ，再消解至１0mL 左右观察,如此反复两三次，注意避免炭化。如仍不能消解完全,则加入高氯酸1-２mL，继续加热至消解完全后,再持续蒸发至高氯酸的白烟散尽,冷却，加水２5ｍL，再蒸发至冒白烟 ，冷却，用水将内容物转入25mＬ容量瓶或比色管中，加入硫脲2．５mＬ,补水至刻度并混匀，备测。 5.1.2 干灰化:一般应用于固体试样。称取1-２.5g(精确至小数点后第二位)于50－100 mＬ坩埚中,同时做两份试剂空白。加 １５0 ｇ/L 硝酸镁10mL混匀,低热蒸干,于电炉上炭化至无黑烟，移入55０ºC高温炉灰化4小时。取出放冷，小心加入(１+1)盐酸10ｍＬ以中和氧化镁并溶解灰分，转入2５mL容量瓶或比色管中,加入硫脲２．5ｍL，另用(1+９）硫酸分次刷洗坩埚后转出合并，直至25mL刻度，混匀备测。 ５．2 标准系列的制备

取10０mL容量瓶6支,依次准确加入1 μg /mＬ砷使用标准液:０、0.1、0.2、０.4、0.8、1．０mL（各相当于砷浓度0、１.0、２.０、4.0、８.０、10.0 ng／ｍL）各加盐酸5 mL,５0g/L硫脲2.5 mL，补加水至刻度,混匀备测。测定时可根据试样测定含量选择标准系列。 5.3 测定

5.3．1 仪器参考条件:

5.3.1.1 仪器开机后,首先进行自检，经检查一切正常后,点火预热３0 mｉｎ。 ５．3.１.2 光电倍增管电压:２7０ V—300V;砷空心阴极灯电流：60ｍA;原子化器:高度8mｍ；氩气流速:45０ mL/min;屏蔽气流量１0０0mL/mｉｎ

5.3.1．3 仪器进样方式采取自动进样。 6 结果计算

按式(1)计算试样的砷含量： X＝式中：

X—试样的砷含量，单位为毫克每千克或毫克每升（ｍｇ/Ｋg或mg/Ｌ) V—试样消化液定容体积,单位为毫升( mｌ ）

Ｃ1—试样被测液的浓度，单位为纳克每毫升（ ng/ｍｌ ） Ｃ0—试样空白液的浓度,单位为纳克每毫升( ng/ｍl ） M—试样的质量或体积，单位为克或毫升（g或ml) 注意:计算结果保留两位有效数字。 ７． 精密度

湿法消解在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１0%。

干法灰化在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 8. 准确度

湿消解法测定的回收率为９0%~1０5%;干灰化法测定的回收率为85%～100%。 9. 注意事项

本实验使用玻璃器皿必须用硝酸（3+1)浸泡过夜,用水反复冲洗,最后用去离子水冲干净。

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(C1C0)V ——(1)

M1000

乳与乳制品非常规理化指标检验

乳制品中硒的检测

YLNＢ ５.１7 １． 范围

本方法规定了用氢化物原子荧光光谱法测定乳制品中硒的方法。 本方法适用于各类乳制品中硒的测定。

本方法检出限为3 ng,线性范围0.01 μg~0．2 μｇ。 2． 原理

试样经酸加热消化后,在6ｍｏｌ/L ＨCL介质中的六价硒还原为四价硒，用硼氢化钠或硼氢化钾作还原剂，将四价硒ＨCＬ介质中还原成硒化氢，由氩气载入石英原子化器中进行原子化,在特制硒空心阴极灯的照射下,基态硒原子光激发至高能态,去活化回至基态时，发射出特征波长的荧光,其荧光强度与被测溶液中的硒浓度成正比，与标准系列比较定量。 3. 试剂

３.１ 硝酸(优级纯) 3.2 盐酸(优级纯） 3.３ 氢氧化钠（优级纯） 3.4 氢氧化钠溶液

３．5 混合酸(4+1) ：４份硝酸＋１份高氯酸 3.6 高氯酸(优级纯)

３.７ 硼氢化钾溶液（8 g/L ）：称取硼氢化钾8．０ g溶于5 g/Ｌ氢氧化钠溶液1000mL中,混匀

３.8 硒标准储备液:此储备液浓度为每毫升相当于１0０ μｇ硒。

硒标准应用液：取10０ug/mＬ硒标准储备液1.0 ｍL，定容至10０mL。此应用液浓度为１ μg／mL。 4. 仪器

4．1原子荧光光度计 4．2电热板 4.3自动控温消化炉 ５. 方法 ５.１ 试样消解

固体试样称取0.50-2． 00 g,液体试样称样5-10 ｇ (或mL )(精确至小数点后第二位）,置入1００－150mＬ锥形瓶中,同时做两份试剂空白。加10mL混合酸和几粒玻璃珠,摇匀后放置过夜,次日置于电热板上加热消解，及时补加混合酸。当溶液变为清亮无色并伴有白烟时,再继续加热至溶液剩余体积2mＬ左右，切不可蒸干.冷却，再加5ｍL ６mol/L HCL,继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，以完全将六价硒还原为四价硒。冷却，转移定容２5mL ～50mL容量瓶中，摇匀待测。 5．2 标准系列的制备

取100ｍＬ容量瓶５支，依次准确加入1 μg ／mL硒标准应用液:0、0.１、0.2、０.4、0．８mL(各相当于硒浓度0、１.0、2.0、4.０、８.０ng／ｍL)各加浓盐酸30.0 mL，补加水至刻度,混匀备测。可根据样品含量增减标准系列的浓度范围。 5.３ 测定

5.３．1 仪器参考条件：

5.3．1.1 仪器开机后,首先进行自检,经检查一切正常后,点火预热30 ｍiｎ。 5.3.１.２ 光电倍增管电压：280 V—32０V；砷空心阴极灯电流：８0mA；原子化器：高度８mm；氩气流速:4５0 mL/ｍiｎ;屏蔽气流量1００0mL／min 5.3.1.3 仪器进样方式采取自动进样。 ６. 结果计算

见式(１)计算试样的硒含量: X＝式中：

X—试样的硒含量，单位为毫克每千克或毫克每升（ｍg/Ｋg或mg/L) Ｖ—试样消化液定容体积,单位为毫升（ ml )

(C1C0)V ——(1）

M1000C1—试样被测液的浓度,单位为纳克每毫升（ ｎg/ml ) C0—试样空白液的浓度,单位为纳克每毫升( ng/ｍl ） Ｍ—试样的质量或体积,单位为克或毫升（g或ｍl） 注意:计算结果表示到小数点后两位。 7. 精密度

重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１0％。 8. 注意事项

本实验使用玻璃器皿必须用硝酸（3+1）浸泡过夜,用水反复冲洗,最后用去离子水冲干净。

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